Effetto di derivati del 2-(fenilammino)-7,8-diidrochinazolin-5(6H)-one su Tau, proteina criticamente coinvolta nella malattia di Alzheimer

In questo elaborato di tesi sono stati analizzati gli effetti cellulari di quattro composti derivati del 2-(fenilammino)-7,8-diidrochinazolin-5(6H)-one, composti 1, 2, 3 e 4 sulla proteina Tau, componente dei grovigli neurofibrillari implicati nella malattia di Alzheimer. La malattia di Alzheimer è una patologia neurodegenerativa e le cellule coinvolte presentano stress ossidativo in parte dovuto ad un aumento dell’attività delle monoammino ossidasi (MAO). In particolare, MAO-B catalizza la deaminazione ossidativa di neurotrasmettitori con la successiva produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS). In queste cellule è stata anche evidenziata un’aumentata attività di proteine chinasi, GSK3β e DYRK1A, che favoriscono una iperfosforilazione della proteina Tau, iperfosforilazione che favorisce la formazione di aggregati proteici. Studi precedenti hanno dimostrato che i derivati 1, 2, 3 e 4 presentano una significativa attività inibitoria nei confronti delle monoammino ossidasi (MAO) e due di questi, 1 e 2, risultano molto selettivi nei confronti dell’isoforma MAO-B. È stata anche dimostrata una debole ma tuttavia significativa attività inibitoria sulla Ser/Thr chinasi GSK3β da parte del composto 1, il quale aveva anche mostrato un effetto a livello cellulare sulla proteina Tau evidenziando un calo del segnale anticorpale in estratti citoplasmatici. Alla luce di questi risultati abbiamo analizzato l’effetto cellulare di questi quattro composti utilizzando cellule SHSY5Y, cellule di neuroblastoma umano utilizzate come modello per le malattie neurodegenerative. I primi esperimenti svolti sono stati dei saggi di vitalità cellulare in cui le cellule sono state trattate con i derivati in esame una concentrazione fino a 30 µM per un tempo di 72h per valutare un possibile effetto citotossico. I risultati ottenuti indicano una mancanza di tossicità di questi quattro composti su questa linea cellulare. L’effetto sulla proteina Tau è stato analizzato trattando le cellule per 24 h con una concentrazione di 30 µM e i lisati cellulari sono stati valutati con una separazione in SDS-PAGE seguita da western blotting e sviluppo con un anticorpo contro la proteina Tau totale. I risultati ottenuti hanno permesso di confermare il calo di segnale anticorpale di Tau in cellule trattate con composto 1. La diminuzione citoplasmatica di Tau è risultata ancora più evidente con il composto 2, mentre i composti 3 e 4 non hanno mostrato tale effetto. Sapendo che la proteina Tau è presente a livello citoplasmatico ma svolge il suo ruolo cellulare anche associata ai microtubuli, abbiamo trattato il pellet derivanti dalla lisi cellulare con N-desacetiltiocolchicina, sostanza depolimerizzante del fuso mitotico. La depolimerizzazione dei microtubuli ottenuta con il trattamento del pellet con 5 µM di desacetiltiocolchicina per 30 min ha permesso di evidenziare un aumento della quantità della proteina Tau associata ai microtubuli nei campioni in cui era evidenziabile un calo della componente citosolica. I risultati ottenuti dimostrano che il trattamento di cellule SHSY5Y con il 1 e 2 inducono una diversa localizzazione di Tau nella cellula.