Rilievo molecolare di Norovirus suini a potenziale zoonotico in campioni fecali

Noroviruses (NoVs) are among the leading agents of gastroenteritis in humans worldwide. The possible correlation between the presence of the virus in pigs, in pig-derived foods, or in contaminated water and the occurrence of infections in humans is an important indication that porcine NoV could potentially be a zoonotic pathogen. The study at the core of this thesis is part of a three-year Ministry of Research project starting in 2020, with the University of Padua, specifically the Department of Comparative Biomedicine and Food Science, as one of the partners. The main objectives of the project were to develop and validate reliable molecular screening and characterization protocols using Next Generation Sequencing (NGS), through which an investigation into the circulation of NoVs in pig farms could be conducted and their adequacy assessed. The ultimate goal was to improve knowledge on their spread, with particular attention to their zoonotic potential, aiming to address the lack of diagnostic tools for the study of these viruses, which had been highlighted by the findings of the RC IZSVe 12/15 research conducted by the Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie (IZSVe), revealing their partial inadequacy. The development of the real-time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (real-time RT-PCR) assay for the identification of porcine NoV initially involved designing a new specific primer pair corresponding to the genomic region between ORF1 and ORF2. The method was then validated by defining its analytical sensitivity and specificity. Subsequently, more than 300 pools of pig feces, collected from six of the seven provinces of Veneto by the competent ASL veterinarians and freelance professionals (LLPP), were analyzed. The dual aim was to verify the diagnostic system implemented with clinical samples from symptomatic and asymptomatic animals and to characterize any NoV-positive samples. The real-time RT-PCR method demonstrated good sensitivity and robustness, making it an effective assay for identifying NoV in pig farms in Veneto, identifying 48 positive fecal samples, including one doubtful, accounting for 17.84% of the collected pools. The fecal samples were accompanied by an anamnestic form collecting data on the type of farm, such as the production address, the number of animals in the barn and in the pens, and the presence and description of symptoms if present. From the collection and analysis of the anamnestic data, it emerged that the highest number of positive pools was observed in the category of pigs aged 151-180 days (N = 10; 30.30%) and that most of the positives involved asymptomatic animals (N = 46/48; 20.54%). Subsequent characterization of some positive samples subjected to NGS allowed for a more detailed analysis of the viral sequences, identifying the genotypes GII.P11 GII.11 (N = 7), GII.P11 (N = 1), and GII.P18 GII.18 (N = 2), all of which appear to be of porcine origin. In conclusion, the new methods provide more and useful information on the spread of NoVs in pig farms in the Veneto region and their genetic variability, proving to be "fit for purpose."

I Norovirus (NoVs) sono tra i principali agenti di gastroenterite nell’uomo a livello mondiale. La possibile correlazione tra la positività al virus nei suini e negli alimenti da essi derivati o in acque contaminate e il riscontro di infezioni nell’uomo sono un segnale importante che indica come il NoV suino possa essere un patogeno potenzialmente zoonosico. Lo studio oggetto dell’elaborato di tesi si inserisce nell’ambito di un progetto di Ricerca Ministeriale di durata triennale a partire dal 2020, che vede tra i partner anche l’Università di Padova e precisamente il Dipartimento di Biomedicina Comparata e Alimentazione. Gli obiettivi principali del progetto erano quelli di sviluppare e validare protocolli di analisi molecolare di screening e caratterizzazione mediante Next Generation Sequencing (NGS) affidabili, attraverso i quali condurre un’indagine sulla circolazione dei NoV negli allevamenti suini e verificarne pertanto l’adeguatezza. Il fine ultimo era quello migliorare le conoscenze sulla loro diffusione, con uno sguardo particolare al loro potenziale zoonosico, cercando di colmare la scarsità di strumenti diagnostici per lo studio di questi virus, emersa dai risultati ottenuti dalla ricerca RC IZSVe 12/15 condotta dall’Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie (IZSVe) che ne aveva rivelato la parziale inadeguatezza. Lo sviluppo del saggio in real time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (real time RT-PCR) per l’identificazione di NoV suini ha inizialmente previsto il disegno di una nuova coppia primer specifica in corrispondenza della regione genomica di giunzione tra ORF1 e ORF2. Il metodo è stato quindi validato attraverso la definizione della sensibilità e specificità analitica. Successivamente, sono stati sottoposti ad analisi oltre 300 pool di feci suine, raccolti in sei delle sette province del Veneto dai Veterinari delle ASL di competenza e dai liberi professionisti (LLPP), con il duplice obiettivo di verificare il sistema diagnostico implementato con campioni clinici di animali sintomatici e asintomatici e caratterizzare eventuali positività al NoV. La metodica di real time RT-PCR ha dimostrato di possedere una buona sensibilità e di essere un saggio robusto ed efficace per l’identificazione di NoV negli allevamenti suini del Veneto, permettendo di identificare 48 campioni di feci positive, di cui un dubbio, pari al 17,84% dei pool raccolti. I campioni di feci prelevati erano accompagnati da una scheda anamnestica in cui sono stati raccolti alcuni dati sulla tipologia di allevamento, come l’indirizzo produttivo, il numero degli animali in stalla e presenti nei box, oltre alla presenza della sintomatologia e della sua descrizione, se presente. Dalla raccolta dei dati anamnestici e della loro elaborazione, è emerso che il maggior numero di pool positivi è stato osservato nella categoria di suini 151-180 giorni di età (N = 10; 30,30%) e che la maggior parte delle positività ha riguardato animali asintomatici (N = 46/48; 20,54%). La caratterizzazione successiva di alcuni campioni positivi sottoposti al sequenziamento con NGS ha consentito di analizzare più dettagliatamente le sequenze virali ed identificare i genotipi GII.P11 GII.11 (N = 7), GII.P11 (N = 1) e GII.P18 GII.18 (N = 2), che sembrano essere tutti di origine suina. In conclusione, le nuove metodiche consentono di ottenere maggiori ed utili informazioni sulla diffusione dei NoV negli allevamenti della regione Veneto e sulla loro variabilità genetica, dimostrandosi “fit for purpose”.