Caratterizzazione farmacologica in vitro di derivati ciclici dell'endomorfina-2

Il recettore mu oppioide è un recettore accoppiato a proteine G di tipo inibitorio. Rappresenta il bersaglio farmacologico di alcuni peptidi oppioidi endogeni e degli alcaloidi oppiacei, quest’ultimi considerati i più efficaci agenti antidolorifici. Tuttavia, la loro azione è accompagnata da gravi effetti collaterali, come costipazione, nausea, depressione respiratoria, tolleranza e dipendenza, che ne limitano l’utilizzo a lungo termine. In questa tesi è stato studiato il profilo farmacologico di 10 analoghi ciclici del peptide oppioide naturale endomorfina-2 (EM-2), con lo scopo di valutare la loro capacità di promuovere l’interazione del recettore mu con la proteina G e con la β-arrestina 2. Discriminare questi due tipi di interazione è importante non solo per affinare la conoscenza sulla trasduzione del segnale ma anche per predire ed interpretare gli effetti biologici in vivo. Al fine di studiare l’effetto dei ligandi nel promuovere l’interazione tra il recettore mu e i due effettori intracellulari, la proteina G e la β-arrestina 2, è stato utilizzato il saggio di Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) il quale permette di misurare queste interazioni in presenza di concentrazioni crescenti di ligando. Il legame recettore-proteina G è stato studiato in membrane ottenute a partire dalle cellule SH-SY5Y di neuroblastoma umano, trasdotte stabilmente con le proteine di fusione mu-Rluc e Gβ1-RGFP; l’interazione recettore-β-arrestina 2 è stata valutata in cellule intere trasdotte con le fusoproteine mu-Rluc e β-arrestina 2-RGFP. Sono stati determinati i valori di potenza ed efficacia dei diversi ligandi ed è stato calcolato il bias factor, un valore numerico che esprime la preferenza dei composti per attivare la via di segnalazione della proteina G rispetto a quella della β-arrestina 2. Come standard di riferimento è stata scelta EM-2. Sulla base dei dati ottenuti si riscontra che i valori di potenza del peptide naturale EM-2 (Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2) sono simili in entrambe le vie di segnalazione, mentre la sostituzione di Tyr1 con Dmt1 ha provocato un aumento di potenza per tutti i peptidi sulla proteina G, risultato che concorda con quanto riportato in letteratura1,2. I valori di efficacia sulla proteina G di tutti i composti, normalizzati rispetto a EM-2, sono compresi tra 0.72 e 1.01, indicando che le modifiche chimiche apportate non hanno determinato variazioni notevoli dell’efficacia dei ligandi sull’interazione recettore mu-proteina G. Per quanto riguarda il legame del recettore mu con la β-arrestina 2, si osserva una maggiore variabilità in termini di efficacia, da molto debole/inattivo (<0.1) ad agonista parziale. I risultati ottenuti dal calcolo del bias factor mostrano che tutti i composti hanno una certa selettività funzionale per la segnalazione della proteina G, mentre EM-2 attiva in egual misura anche la via della β-arrestina 2. La sostituzione di Tyr1 con Dmt provoca una riduzione del bias. Inoltre, è interessante notare come la sostituzione di Phe2 o Phe3 con l’amminoacido non naturale (R)β3-1Nal nei composti 514, 510 e 515 determini una completa perdita di capacità di reclutare la β-arrestina 2. In conclusione, questi composti potranno essere utili per ulteriori studi volti a determinarne il profilo analgesico in vivo e più in generale a comprendere il valore del fenomeno della “selettività funzionale” quale strategia farmacologica per generare farmaci analgesici innovativi meglio tollerati rispetto ai composti disponibili in terapia.