Il potenziale terapeutico degli isotiocianati in Fibrosi Cistica: il Sulforafano come esempio

Introduction: Cystic fibrosis is the most common autosomal recessive genetic disease in the Caucasian population. It is responsible for the secretion of particularly thick and viscous mucus by the exocrine glands, which compromises, in particular, the normal function of pancreas and lungs, making them prone to frequent infections and chronic inflammation. The molecular basis of this symptomatology lies on the presence of mutations in both alleles of the CFTR gene, which encodes the CFTR transmembrane channel (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). This channel is responsible for the transport of chloride and bicarbonate outside the cell. This event is fundamental for the physiological hydration of mucus and proper lung function. So far, more than 2000 possible mutations capable of causing the disease had been identified, with the most common being F508del-CFTR. Patients homozygous for this mutation have only 1% of the functional channel in the membrane and compromised lung function. Currently, a therapy approved by the FDA and EMA (Trikafta®) is available, but it is limited to a small number of patients, as it is specific to certain CFTR mutations, including F508del-CFTR. Moreover, it presents some liver-related side effects, and its long-term effectiveness is still under study. Aim of the study: It has been demonstrated that the repeated synthesis and degradation of CFTR produce an oxidative imbalance, caused by excessive production of Reactive Oxygen Species (ROS). This event is accompanied by a simultaneous reduction in the cell's antioxidant defenses, particularly involving the signal transduction pathway controlled by the transcription factor Nrf2 (Nuclear Factor Erythroid 2- related factor-2), which regulates the translation of several proteins necessary for antioxidant activity. Nrf2 activity is controlled by its partner Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1), which, by binding to the transcription factor, induces its ubiquitination. The oxidation of specific Keap1 cysteines alters its structure, leading to the release of Nrf2, which then migrates to the nucleus and binds to AREs (Antioxidant Response Elements), promoting the synthesis of the cited proteins. The aim of the study is to identify possible compounds capable of interacting with the Nrf2/Keap1 complex to increase Nrf2 activity and counteract the rise in ROS observed in cystic fibrosis patients. Materials and Methods: Cell culture maintenance, Western Blot, immunofluorescence techniques and flow cytometry (Tietze assay, Bodipy). Results: The compound selected for this study is sulforaphane, a molecule belonging to the isothiocyanate family, present in appreciable amounts in plants of the Brassicaceae family such as broccoli, radishes, arugula, and cabbage. The results obtained showed that this molecule can increase Nrf2 activity, glutathione levels, and reduce the cellular pro-oxidative state. Finally, the molecule has proven to be effective as a potentiator in combination with potential correctors.

Introduzione: La fibrosi cistica è la malattia genetica autosomica recessiva più frequente nella popolazione caucasica. È responsabile della secrezione da parte delle ghiandole esocrine di muco particolarmente denso e viscoso, che compromette in particolare la normale funzionalità di pancreas e polmoni, predisponendoli a frequenti infezioni e infiammazioni croniche. Alla base di questa sintomatologia vi è la presenza di mutazioni su entrambi gli alleli del gene CFTR, codificante il canale transmembrana CFTR (Regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica). Quest’ultimo è responsabile del trasporto di cloro e bicarbonato all’esterno della cellula, necessario per la fisiologica idratazione del muco e la corretta funzionalità polmonare. Al momento sono state individuate più di 2000 possibili mutazioni in grado di causare la malattia, di cui la più frequente è la F508del-CFTR. Pazienti omozigoti per tale mutazione presentano solamente l’1% del canale in membrana e funzioni polmonari compromesse. Attualmente esiste una terapia approvata dall’FDA e dall’EMA (Trikafta®) limitata però ad un numero esiguo di pazienti, in quanto specifica per alcune mutazioni del CFTR, tra cui l’F508del- CFTR. Inoltre, presenta alcuni effetti collaterali a livello epatico e la sua efficacia a lungo termine resta ancora oggetto di studio. Scopo della tesi: È stato dimostrato che la reiterata sintesi e degradazione del CFTR producono uno squilibrio ossidativo, provocato da un’eccessiva produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS). Questo evento è accompagnato da una contemporanea riduzione delle difese antiossidanti della cellula, con particolare riferimento alla via di trasduzione del segnale controllata dal fattore di trascrizione Nrf2 (Erythroid 2-related factor-2), regolante la traduzione di una serie di proteine necessarie all’attività antiossidante. L’attività di Nrf2 è controllata dal suo partner Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1) il quale, legandosi al fattore di trascrizione, ne provoca l’ubiquitinazione. L’ossidazione di specifiche cisteine di Keap1 ne modifica la struttura provocando il rilascio di Nrf2 che migra nel nucleo e si lega ai promotori ARE (Antioxidant Response Elements) promuovendo la sintesi delle proteine sopra citate. Lo scopo dello studio è quello di identificare possibili composti in grado di interagire con il complesso Nrf2/Keap1 al fine di aumentare l’attività di Nrf2 e di contrastare l’aumento di ROS presente nei pazienti affetti da Fibrosi Cistica. Materiali e Metodi: Mantenimento di culture cellulari, Western Blot, tecniche d’immunofluorescenza e citofluorimetria (Tietze assay, Bodipy). Risultati: Il composto selezionato come oggetto di studio è il sulforafano, una molecola appartenente alla famiglia degli isotiocianati e presente in quantità apprezzabili in piante della famiglia delle Brassicaceae come broccoli, ravanelli, rucola e cavoli. I risultati ottenuti hanno dimostrato che tale molecola è in grado di aumentare l’attività di Nrf2, i livelli di glutatione e diminuire lo stato pro- ossidativo cellulare. Infine, la molecola si è dimostrata efficace come potenziatore in combinazione con gli eventuali correttori.