Saggio di luciferasi per lo screening di agenti destabilizzanti i G4 del SVA di XDP

Introduction X-linked dystonia-parkinsonism (XDP) is a disease characterized by the insertion of a SINE-VNTR-Alu (SVA) retrotransposon in the TAF1 gene. Each patient has a different number of repeats in the hexameric domain (HEX) of the SVA, and this has been correlated with severity of symptoms and younger age at onset. SVA reduces TAF1 transcription because it can adopt G-quadruplex (G4) structures, particularly in the HEX, which would interfere with gene transcription. To date, we have many molecules that can stabilize G4s, but far fewer strategies to destabilize them. A new approach is to use oligonucleotides complementary to the G4 sequence but modified with LNA bases as destabilizing agents. Materials and methods U-2 OS cells were used as the cell model for the luciferase assay. The plasmids have an SVA promoter containing 0-36-39-52 repeats in the HEX. BRACO-19 was tested as a G4 stabilizing molecule and PhpC as a G4 destabilizing molecule. Three LNAs were screened for G4 destabilization. Results Luciferase expression varies according to the length of the plasmid HEX. This is due to the presence of G4s in the HEX, since opposite trends were observed when treated with BRACO-19 or PhpC, defining that in this case G4s favour trascription. We then used this model to screen three LNAs and define which modifications were useful for destabilizing G4s in the HEX. Conclusions Luciferase expression depends on the number of repeats in the HEX. This assay may be useful as an in vitro test for LNA screening but requires further optimisation.

Introduzione La distonia-parchinsonismo legata dall’X (XDP) è una malattia caratterizzata dall'inserzione di un retrotrasposone di tipo SINE-VNTR-Alu (SVA) nel gene TAF1. Ogni paziente ha un numero variabile di ripetizioni del dominio esamerico (HEX) del SVA, e questo è stato correlato con la severità dei sintomi e un’età minore all’esordio della malattia. L’SVA riduce la trascrizione di TAF1 in quanto può adottare strutture G-quadruplex (G4), in particolare nel dominio HEX, le quali interferiscono con la trascrizione del gene. Ad oggi disponiamo di numerose molecole in grado di stabilizzare i G4, ma molte meno strategie per destabilizzarli. Un recente approccio prevede l’uso di oligonucleotidi complementari alla sequenza G4 ma modificati con basi a LNA come agenti destabilizzanti. Materiali e metodi Le cellule U-2 OS sono state usate come modello per il saggio di luciferasi. I plasmidi usati per il saggio di luciferasi hanno come promotore un SVA contenente 0-36-39-52 ripetizioni nel HEX. Sono stati testati BRACO-19 come molecola G4-stabilizzante e PhpC come molecola G4-destabilizzante. Sono stati screenati tre LNA come G4-destabilizzanti. Risultati L’espressione della luciferasi dipende dalla presenza di G4 nel SVA, in particolare nel dominio HEX. Sono state osservate tendenze opposte trattando con BRACO-19 o PhpC, definendo che in questo caso i G4 favoriscono la trascrizione. Abbiamo quindi utilizzato questo modello per screenare tre LNA e definito quali modifiche fossero utili per la destabilizzazione dei G4 nel HEX. Conclusioni L’espressione della luciferasi dipende dal numero di G4 presenti nell’HEX. Questo saggio può essere utile come test in vitro per lo screening di LNA ma necessita di ulteriori ottimizzazioni.