Ibridazione in situ e next generation sequencing per la rilevazione di riarrangiamenti a carico del gene FGFR2 in una coorte di colangiocarcinomi intraepatici

Introduction: Intrahepatic cholangiocarcinomas (CCAi) are rare neoplasms arising from the biliary tract and characterized by a poor prognosis due to late diagnosis and limited therapeutic options. The molecular characterization of these tumors is essential to provide patients with other therapeutic options, when the tumor becomes resistant to first line treatment. Approximately 70% of them present at least one genetic alteration, despite most of them are currently not druggable. The most frequent genetic alterations in CCAi are located in IDH1 and FGFR2 genes. Recently, second-line molecular targeted drugs, for patients harboring these mutations, have recently been approved, including IHD1 inhibitors (ivosidenib) and FGFR inhibitors (pemigatinib). The employment of diagnostic techniques able to detect these alterations with high sensitivity and specificity is essential, especially considering that in most cases diagnosis must be assessed in small biopsies or cytological brushings which are characterized by low cellularity. Aim: Different methods are currently used in daily diagnostic practice: molecular techniques such as next generation sequencing (NGS) and cytogenetic techniques such as fluorescent in situ hybridization (FISH). The aim of the thesis is to identify the method of first choice for FGFR2 gene alterations identification. Materials and methods: 24 cases of patients affected by CCAi and treated at Veneto Oncology Institute were selected and subjected to NGS and FISH analysis in order to compare the results. Results: The comparison of the two methods highlighted that using the NGS technique, 67% of cases found the presence of rearrangements while 8% were not rearranged. Since the quantity of RNA obtained from the FFPE tissue was found to be insufficient for library preparation, in 25% of the cases analyzed with NGS, it was not possible to determine the FGFR2 status. With the FISH method, however, 45,8% of cases were rearranged and 16,7% showed no rearrangements, while nine cases, 37,5% of cases, were not evaluable, probably due to inadequate treatment of the tissue in the pre-analytical phase. Two cases for which it was not possible to proceed with NGS analysis were found to be evaluable by FISH, while considering the cases evaluable with both methods, one case analyzed present a discrepant diagnosis, resulting rearranged if evaluated with NGS and wild-type in FISH. Conclusions: The analysis of the results demonstrates that the choice of the method to assess FGFR2 status must be defined based on the sample features (i.e. cellularity) using a ‘sample personalized’ approach.

Introduzione: I colangiocarcinomi intraepatici (CCAi) sono neoplasie rare che insorgono nel tratto biliare e sono caratterizzate da prognosi infausta a causa della diagnosi tardiva e delle scarse opzioni terapeutiche. Caratterizzare a livello molecolare queste neoplasie è indispensabile per poter offrire ai pazienti ulteriori opzioni terapeutiche, nel momento in cui la neoplasia non risponde più al trattamento di prima linea basato sulla combinazione di cisplatino e gemcitabina. Circa il 70% di essi, infatti, presenta almeno un’alterazione genica, di queste però, solo alcune risultano essere targettabili, con specifici farmaci. Le alterazioni genetiche più frequenti nei CCAi sono a carico dei geni IDH1 e FGFR2, per le quali recentemente sono stati approvati farmaci a bersaglio molecolare, di seconda linea, quali, gli inibitori di IDH (ivosidenib) e inibitori di FGFR (pemigatinib). L’utilizzo di tecniche diagnostiche utili a rilevare queste alterazioni con elevata sensibilità e specificità è di fondamentale importanza, soprattutto se si considera che, nella maggior parte dei casi il materiale a disposizione è rappresentato da piccole biopsie o brushing citologici ed è quindi complesso da analizzare, vista la ridotta cellularità. Scopo: Attualmente nella routine diagnostica, per la definizione dello status di FGFR2 sono impiegate metodiche diverse, tra cui tecniche molecolari di next generation sequencing (NGS) e tecniche citogenetiche come la fluorescence in situ hybridization (FISH). Lo scopo della tesi è quello di individuare la metodica d’elezione per l’identificazione di alterazioni del gene FGFR2. Materiali e metodi: A tale scopo, sono stati selezionati 24 casi di pazienti affetti da CCAi trattati presso l’Istituto Oncologico Veneto e sono stati sottoposti ad analisi NGS e FISH per poter comparare i risultati. Risultati: Il confronto delle due metodiche ha messo in evidenza che utilizzando la tecnica NGS il 67% dei casi hanno riscontrato la presenza di riarrangiamenti mentre l’8% risulta non riarrangiato. Poiché la quantità di RNA ottenuta da tessuto FFPE è risultata non sufficiente alla preparazione della libreria, nel 25% dei casi analizzati con NGS, non è stato possibile determinare lo status di FGFR2. Con metodica FISH invece il 45,8% dei casi risulta riarrangiato e il 16,7% non evidenzia riarrangiamenti mentre nove casi, il 37,5% dei casi non sono risultati valutabili probabilmente a causa di un inadeguato trattamento del tessuto nella fase pre-analitica. Due casi per cui non è stato possibile procedere con analisi NGS, sono risultati valutabili mediante FISH, mentre considerando i casi valutabili con entrambe le metodiche, un caso presenta diagnosi discrepante, risultando riarrangiato se valutato con metodica NGS e wild-type in FISH. Conclusioni: L’analisi dei risultati dimostra che la scelta della metodica da impiegare deve essere ‘personalizzata’ sul campione e definita in base alle caratteristiche del campione (ad esempio cellularità neoplastica)