STUDIO SU MUTANTI DELLA PROTEINA CK2 IDENTIFICATI IN PAZIENTI DI POBINDS (POIRIER-BIENVENU NEURODEVELOPMENTAL SYNDROME)

CK2 è una proteinchinasi costitutivamente attiva e ubiquitaria, che fosforila proteine presenti in molte vie di segnalazione cellulare. Normalmente in cellule è un tetramero composto da due subunità catalitiche e due regolatorie. Le subunità catalitiche possono essere di due tipi, CK2α o CK2α’. Le subunità regolatorie sono di un solo tipo, CK2β, codificata dal gene CSNK2B. CK2 è essenziale per la sopravvivenza cellulare e una sua riduzione comporta condizioni patologiche. In questa tesi si sono studiate varianti di CK2β presenti in pazienti di Poirier-Bienvenu neurodevelopmental syndrome (POBINDS), una malattia genetica rara causata da mutazioni del gene CSNK2B. Obiettivi 1. mettere a punto il protocollo per la trasfezione stabile di CK2 mutata, per ottenere linee cellulari che simulino le condizioni del POBINDS 2. analizzare eventuali deficit di attività di CK2 nelle linee trasfettate 3. identificare un attivatore di CK2 e ottimizzare le condizioni per il suo utilizzo in cellule Metodologia Per gli esperimenti si sono usate cellule HEK293AD, cresciute in terreno di coltura “DMEM High Glucose” con aggiunta di siero bovino al 10% (v/v). Le analisi si sono svolte mediante Western Blot, per rilevare le proteine di interesse con opportuni anticorpi, dopo aver separato le proteine dei lisati cellulari mediante gel di poliacrilammide in SDS e trasferimento su membrane PVDF. Le bande di rilevazione anticorpale sono state quantificate tramite Imagej. Risultati La trasfezione ha avuto successo nel caso del controllo (CK2 wild type), mentre l’espressione di CK2 mutata si osserva a tempi brevi, ma poi la proteina viene rapidamente eliminata dalle cellule, impedendo la messa a punto di linee stabili. Per quanto riguarda l’attivatore di CK2, si sono riscontrate difficoltà nell’internalizzazione dei composti nelle cellule. Il processo è stato ottimizzato eliminando il siero bovino dal mezzo di coltura, ma gli effetti attivatori su CK2 sono risultati non sempre riproducibili.