RUOLO DEL BMF NELLA RISPOSTA DELLE LEUCEMIE LINFOBLASTICHE ACUTE A CELLULE T AL TRATTAMENTO CON FARMACI INDUTTORI DI APOPTOSI.

Background: T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) is an aggressive hematological cancer in pediatric patients, T-ALL represents 10-15% of all cases of acute lymphoblastic leukemia (ALL), the most common pediatric malignancy. T-ALL originates in the thymus from immature lymphocytes because of a progressive accumulation of genetic and epigenetic modifications. T-ALL has a good prognosis thanks to the administration of intensive therapeutic protocols; nevertheless, approximately 25% of pediatric patients show primary or secondary resistance. Previous studies performed in our laboratory have demonstrated that the combination of the mTORC1 inhibitor, Everolimus, and the inhibitor of the anti-apoptotic protein BCL-2, Venetoclax, acts synergistically in inducing cell death of T-ALL. However, the response of different cell lines appears heterogeneous as some cells are highly sensitive, while others are resistant. RNA-seq data suggest an involvement of the pro-apoptotic BCL-2 modifying factor (BMF) in the response of T-ALL cells to the treatment. Based on these results, this study aims to explore the role of the BMF in determining the sensitivity of T-ALL cell lines to the combination of these two drugs. Methods: To perform these studies, we used cell culture techniques, gene silencing, flow cytometry, real-time RT-PCR, and western blot. Results: Our western blot experiments demonstrate that the sensitive cell lines expressed BMF, while the resistant cell lines did not express the protein. Furthermore, Everolimus treatment increased BMF expression in sensitive cells but did not affect resistant cells. Consistent with this finding, silencing of BMF using siRNA makes sensitive cells refractory to Everolimus + Venetoclax. On the contrary, in cells that did not express the protein, its induction by administration of the histone deacetylase inhibitor, Trichostatin A, increased sensitivity to Everolimus + Venetoclax. Conclusions: These results highlight the critical role of the pro-apoptotic protein BMF in the response of T-ALL to the treatment with Everolimus + Venetoclax.

Introduzione: La leucemia linfoblastica acuta a cellule T (T-ALL) è un tumore ematologico aggressivo. Nei pazienti pediatrici la T-ALL rappresenta il 10-15% di tutti i casi di leucemia linfoblastica acuta (ALL), la più comune neoplasia pediatrica. La T-ALL origina nel timo da linfociti immaturi come conseguenza di un progressivo accumulo di modificazioni genetiche ed epigenetiche. Grazie alla somministrazione di protocolli terapeutici intensivi, ad oggi, la T-ALL presenta una buona prognosi nella maggior parte dei casi; nonostante ciò, circa il 25% dei pazienti pediatrici rimane incurabile. Precedenti studi condotti nel nostro laboratorio hanno dimostrato che la somministrazione combinata dell’inibitore del pathway di mTORC1, Everolimus, e dell’inibitore della proteina anti-apoptotica BCL-2, Venetoclax, agisce in maniera fortemente sinergica nell’indurre morte cellulare delle T-ALL. Tuttavia, la risposta delle diverse linee cellulari risulta essere eterogenea, con alcune linee cellulari altamente sensibili e altre resistenti. L’analisi di RNA-seq sembrerebbe indicare un coinvolgimento della proteina pro-apoptotica BCL-2 modifying factor (BMF) nella risposta al trattamento. Sulla base di questi risultati preliminari, l’obiettivo di questa tesi di laurea è analizzare il ruolo del BMF nel determinare la sensibilità delle linee cellulari di T-ALL alla combinazione di questi due farmaci. Metodi: Per effettuare questi studi abbiamo utilizzato tecniche di coltura cellulare, silenziamento genico, citofluorimetria, real-time RT-PCR e western blot. Risultati: I nostri esperimenti di western blot dimostrano che il BMF è espresso nelle linee cellulari sensibili ed è assente nelle linee cellulari resistenti. Inoltre, il trattamento con Everolimus incrementa l’espressione del BMF nelle cellule sensibili, ma non ha alcun effetto nelle cellule resistenti. Inoltre, abbiamo dimostrato come il silenziamento di BMF mediante l’utilizzo di silencing RNA (siRNA, loss of function) renda le cellule sensibili refrattarie al trattamento con Everolimus + Venetoclax. Al contrario, nelle cellule che non esprimono la proteina, la sua induzione mediante somministrazione dell’inibitore delle deacetilasi istoniche, Tricostatina A, aumenta la sensibilità a Everolimus + Venetoclax. Conclusioni: I nostri risultati evidenziano il ruolo chiave della proteina pro-apoptotica BMF nella risposta delle T-ALL al trattamento con Everolimus + Venetoclax.