Modelli in vitro per la caratterizzazione fenotipica di virus neurotropi

Introduzione. Una delle principali sfide globali attuali è l'incremento delle malattie infettive "emergenti," cioè malattie mai osservate in precedenza o che si manifestavano solo sporadicamente in aree limitate. In particolare, l’emergere di un nuovo patogeno nella odierna società globalizzata può portare a effetti devastanti, anche in Paesi sviluppati. Tra i principali fattori che hanno permesso un aumento dell’incidenza di queste malattie troviamo i cambiamenti climatici, la globalizzazione e viaggi internazionali, che hanno aumentato la diffusione e la migrazione di vettori per agenti infettivi come zanzare, flebotomi o zecche. L’evoluzione della moderna ricerca scientifica multidisciplinare ha permesso di comprendere meglio questi patogeni e la loro interazione con l’uomo, grazie all’utilizzo di sistemi in vitro sempre più sofisticati. Scopo dello studio. Sviluppare un modello in vitro di cellule del sistema nervoso centrale umano al fine di caratterizzare la risposta antivirale ed infiammatoria in seguito ad infezione con virus neurotropi, come West Nile virus (WNV) e Toscana virus. Questi modelli neuronali sono sviluppati a partire da cellule staminali umane differenziate in neuroni e cellule della microglia. Materiali e metodi. I neuroni corticali sono stati differenziati da cellule staminali H9 esprimenti la neurogenina (H9-NGN), già presenti in laboratorio. Le cellule della microglia (iMG) invece sono state differenziate dalla linea cellulare staminale H9 (WA09-WiCell) nella quale sono stati fatti esprimere i geni CEBPA e hSPI1 per il differenziamento della microglia, tramite produzione di particelle lentivirali ricombinanti e/o trasfezione del vettore tramite Lipofectamina® (Thermo Fisher Scientific, USA). Le cellule sono state caratterizzate mediante analisi in immunofluorescenza e real time PCR di marcatori di differenziamento cellulare. Successivamente sono state infettate con WNV lineage 1-22 e WNV lineage 2-22 e TOSV ceppi INMI e 1812. Le cellule infettate ed i surnatanti sono stati raccolti per valutare la cinetica di replicazione virale tramite real time PCR ed analizzati i livelli di citotossicità tramite Citotoxicity Detection KitPLUS (LDH, Roche). Risultati. È stato sviluppato un modello di infezione in vitro valido per studiare gli effetti che i virus neurotropici hanno sul sistema nervoso. In particolare sono state ottenute, a partire dalle cellule staminali embrionali, due linee cellulari, costituite rispettivamente da neuroni corticali e dalle cellule della microglia. Una volta ottenute, le due linee cellulari sono state caratterizzate genotipicamente e fenotipicamente tramite Real-Time PCR e immunofluorescenza. Inoltre, è stato dimostrato che, in seguito ad infezione con WNV e TOSV, si ha un aumento della citotossicità cellulare e della risposta pro-apoptotica. Conclusioni: Le cellule neuronali derivate da cellule staminali embrionali sono risultate utili per studiare il neurotropismo di diversi virus. Gli studi pilota eseguiti su questo modello saranno approfonditi tramite esperimenti di RNA-seq e saggio TCID50. I modelli neuronali saranno ampliati al fine di studiare l’infezione di cellule della microglia o di altre cellule del SNC, anche in co-coltura per valutarne il tropismo virale.