SVILUPPO E VALIDAZIONE DI UN METODO QUANTITATIVO IN REAL-TIME PCR PER LA QUANTIFICA DELLA CARICA INFETTIVA DEL VIRUS DEL VAIOLO DELLE SCIMMIE

Introduction: Monkeypox (MPXV) is the virus that causes the disease known as monkey smallpox. It is a zoonotic disease, which in endemic countries (Central and West Africa) is transmitted mainly through direct contact between an infected animal and man. Since 2022, numerous outbreaks with inter-human transmission have also been reported. This increased spread of the virus has led to the WHO for the first time declaring monkey pox an international health emergency. Most studies on MPXV have developed antigen recognition methods and rapid molecular tests. These techniques are not useful to check for both the presence of the virus and its charge, further methods are needed. Materials and methods: The viral DNA of MPXV was extracted from the supernatant of infected cells. The F3L and G2R genes of the virus were then amplified, and the resulting amplicons were inserted into cloned plasmids of type pJet1.2/blunt (Thermo Fisher Scientific TM), containing the gene for selection for ampicillin resistance. The plasmids obtained were transformed into bacterial cells (Escherichia coli, strain DH5α), then grown in selective LB soil. Some of the grown colonies were selected and the plasmids contained were purified by alkaline lysis technique. The purification product was then digested with the restriction enzyme BglII, which operates an excision cut in correspondence of the two recognition sequences. Enzymatic digestion showed whether the PCR product of F3L and G2R was actually inserted into the plasmids of selected colonies. Finally, commercially purified stocks of the two plasmids of interest were created and conditions set for their use in Real-time PCR as standard measures for calculating the number of viral genome copies from unknown samples. Results: We have formed two cloning plasmids that present the insertion of the amplicon F3L or the amplicon G2R. The plasmids were then used in scalar dilutions to create two calibration lines. The linearity of the lines was investigated by working on the concentration ratio between primers and probe. Conclusions: In this study, a calibration line was created and developed to estimate the number of virus genome copies in infected human cells. The real-time PCR system has been found to be effective for the F3L gene, while for the G2R gene more experiments and research are needed to obtain an adequate ratio of primer to probe in the reaction MIX. The calibration line obtained for G2R does not describe the number of genome copies in a precise and linear manner as that reported for F3L.

Introduzione:Il Monkeypox (MPXV) è il virus che causa la patologia nota con il nome di vaiolo delle scimmie. Si tratta di una malattia zoonotica, che nei paesi endemici (Africa centrale ed occidentale) si trasmette principalmente attraverso il contatto diretto tra un animale infetto e l’uomo. Dal 2022 sono stati segnalati, altresì, numerosi focolai a trasmissione interumana. Questa aumentata diffusione del virus ha portato per la prima volta l’OMS a dichiarare il vaiolo delle scimmie un’emergenza di salute internazionale. La maggior parte degli studi svolti su MPXV hanno messo a punto metodi di riconoscimento antigenico e test molecolari rapidi. Queste tecniche non sono utili a verificare sia la presenza del virus che la sua carica, ulteriori metodi si rendono necessari. Materiali e metodi: Il DNA virale di MPXV è stato estratto a partire dal surnatante di cellule infettate. In seguito, sono stati amplificati i geni F3L e G2R del virus, e gli ampliconi ottenuti sono stati inseriti in plasmidi di clonaggio di tipo pJet1.2/blunt (Thermo Fisher Scientific™), contenente il gene di selezione per la resistenza all’ampicillina. I plasmidi ottenuti sono stati trasformati in cellule batteriche (Escherichia coli, ceppo DH5α), cresciute poi in terreno LB selettivo. Sono state selezionate alcune delle colonie cresciute e i plasmidi contenuti sono stati purificati mediante la tecnica di lisi alcalina. Il prodotto di purificazione è stato poi digerito con l’enzima di restrizione BglII, che opera un taglio di excisione in corrispondenza delle due sequenze di riconoscimento. La digestione enzimatica ha mostrato se il prodotto di PCR di F3L e G2R fosse stato effettivamente inserito nei plasmidi delle colonie selezionate. Infine, sono stati creati stock purificati con metodi commerciali dei due plasmidi di interesse e sono state settate le condizioni per utilizzarli in Real-time PCR come misure standard per il calcolo del numero di copie genoma virali da campioni ignoti. Risultati: Abbiamo costituito due plasmidi di clonaggio che presentano l’inserzione dell’amplicone F3L o dell’amplicone G2R. I plasmidi sono stati poi utilizzati in diluizioni scalari per creare due rette di taratura. La linearità delle rette è stata ricercata lavorando sul rapporto di concentrazione tra primers e sonda. Conclusioni :In questo studio è stata creata e messa a punto la retta di taratura per valutare il numero di copie genoma del virus in cellule umane infettate. Il sistema in Real-time PCR è risultato efficace per il gene F3L, mentre per il gene G2R sono necessari più esperimenti e ricerche per ottenere un rapporto adeguato tra primer e sonda nella MIX di reazione. La retta di taratura ottenuta per G2R, infatti, non descrive il numero di copie genoma in modo preciso e lineare come quella riportata per F3L.