Analisi del flusso mitofagico tramite sonda fluorescente MitoKeima in cellule umane

In this study was analyzed the mitophagical flux in HEK293T cells using the mtx-mKeimaXL probe in the context of USP8 DUB inhibition, with the use of the biochemical technique Western Blot for the detection and quantification of the proteins in the samples. DUBs are proteins involved in various cellular processes including mitochondrial degradation through mitophagy, in particular they remove ubiquitin chains from target proteins, which in physiological conditions recruit the phagophore to initiate mitophagy. Theoretically, inhibition of USP8 should lead to increased ubiquitination levels of proteins on the mitochondrial outer membrane, resulting in enhanced mitophagy, that could offer potential therapeutic effects for neurodegenerative diseases characterized by mitochondrial dysfunction. Inhibition was carried out using the specific USP8 inhibitor, DUB-IN-2. Treatments with this molecule were performed on HEK293T cells transfected with the mtx-mKeima probe. Mitophagy levels were subsequently analyzed using Western Blot, visualizing the mitochondrial and lysosomal bands of the probe. Although the experiment yielded positive results, they were not particularly significant, since, although inhibition of USP8 was confirmed, mitophagic flux did not reach high levels. This is likely due to the fact that the method involves several critical steps that still need to be optimized and refined for clearer quantification.

In questo studio si è analizzato il flusso mitofagico in cellule HEK293T mediante la sonda mtx-mKeimaXL in un contesto di inibizione della DUB USP8, con l’impiego della tecnica biochimica Western Blot per la rilevazione e quantificazione delle proteine nei campioni. Le DUBs sono proteine coinvolte in tanti processi cellulari tra cui la degradazione mitocondriale attraverso il processo della mitofagia, in particolare rimuovono le catene di ubiquitina da proteine bersaglio, che in condizioni fisiologiche richiamano il fagoforo per l’iniziazione della mitofagia. Teoricamente, l'inibizione di USP8 dovrebbe comportare un aumento dei livelli di ubiquitilazione delle proteine sulla membrana esterna dei mitocondri, con un conseguente incremento della mitofagia, offrendo un potenziale effetto terapeutico nelle malattie neurodegenerative caratterizzate da disfunzione mitocondriale. L'inibizione è stata eseguita utilizzando l'inibitore specifico per USP8, DUB-IN-2. I trattamenti con questa molecola sono stati effettuati su cellule HEK293T trasfettate con la sonda mtx-mKeima. I livelli di mitofagia sono stati successivamente analizzati tramite la tecnica Western blot, visualizzando le bande mitocondriali e lisosomiali della sonda. Sebbene l'esperimento abbia prodotto risultati positivi, questi non sono stati particolarmente significativi, poiché, pur essendo stata confermata l'inibizione di USP8, il flusso mitofagico non ha raggiunto tassi elevati. Questo probabilmente a causa del fatto che la tecnica prevede diversi passaggi chiave che devono ancora essere ottimizzati e definiti per una quantificazione più chiara.