Sviluppo di un modello tridimensionale di sferoidi con fibroblasti polmonari da utilizzare per la sperimentazione in vitro

The in vitro study of the mechanisms responsible for the altered production of extracellular matrix (ECM) in fibrotic pathologies, such as pulmonary ones, requires the use of three-dimensional (3D) models. To this end, spheroids derived from lung fibroblasts currently represent one of the main structures used to analyze both the interaction between lung cells and the synthesis of ECM molecules. The aim of this thesis was to develop a method for the laboratory generation of lung fibroblast spheroids and to evaluate both the viability of the cells that constitute them and the presence of ECM within their 3D structure. To achieve this goal, lung spheroids with a diameter of 300-400 µm were generated, using human fibroblasts in primary culture and matrigel, an organic matrix that prevents the adhesion of the structures to the culture plate. The structural organization and presence of the ECM within the spheroids were analyzed using specific stains and subsequent observation under the microscope. The viability and proliferation of the cells were evaluated with the use of adequate metabolic tests, while the expression of type I collagen, a fundamental component of the pulmonary ECM, was determined at the gene level with the qPCR technique and at the protein level with immunohistochemistry. The results obtained from the study demonstrated that, to generate well-defined spheroids, is necessary the use of 104 human lung fibroblasts per well in a 96-well culture plate. Observation under the optical microscope and analysis of cell viability showed that the cells inside the spheroids remain viable and proliferate for up to eight days of culture. Furthermore, qPCR and immunohistochemistry analyses confirmed the presence of type I collagen within the spheroid. In conclusion, this preliminary study allowed us to generate reproducible spheroids that can be used to analyze the behavior of human lung fibroblasts in a 3D culture system.

Lo studio in vitro dei meccanismi responsabili dell’alterata produzione di matrice extracellulare (MEC) nelle patologie di tipo fibrotico, come ad esempio quelle polmonari, richiede l’uso di modelli tridimensionali (3D). A questo scopo, gli sferoidi derivati da fibroblasti polmonari rappresentano attualmente una delle principali strutture utilizzate per analizzare sia l’interazione tra le cellule polmonari sia la sintesi di molecole della MEC. L’obiettivo di questa tesi è stato quello di sviluppare un metodo per la generazione in laboratorio di sferoidi di fibroblasti polmonari e di valutare sia la vitalità delle cellule che li costituiscono, sia la presenza di MEC all’interno della loro struttura 3D. Per raggiungere tale scopo, sono stati generati sferoidi polmonari del diametro di 300-400 µm, utilizzando fibroblasti umani in coltura primaria e matrigel, una matrice organica che impedisce l’adesione delle strutture alla piastra di coltura. L’organizzazione strutturale e la presenza della MEC all’interno degli sferoidi sono state analizzate utilizzando colorazioni specifiche e con la successiva osservazione al microscopio. La vitalità e la proliferazione delle cellule sono state valutate con l’uso di adeguati test metabolici, mentre l’espressione del collagene di tipo I, una componente fondamentale della MEC polmonare, è stata determinata a livello genico con la tecnica qPCR e a livello proteico con l’immunoistochimica. I risultati ottenuti dallo studio hanno dimostrato che, per ottenere sferoidi ben definiti, è necessario l’impiego di 104 fibroblasti polmonari umani per pozzetto in una piastra di coltura da 96 pozzetti. L’osservazione al microscopio ottico e l’analisi della vitalità cellulare hanno evidenziato che le cellule all’interno degli sferoidi rimangono vitali e proliferano fino a otto giorni di coltura. Inoltre, le analisi qPCR e di immunoistochimica hanno confermato la presenza di collagene di tipo I all’interno dello sferoide. In conclusione, questo studio preliminare ha permesso di generare sferoidi riproducibili che possono essere utilizzati per analizzare il comportamento di fibroblasti polmonari umani in un sistema di coltura 3D.