Introduzione: La trombocitopenia immune (ITP) è una rara malattia ematologica acquisita, caratterizzata dalla distruzione immuno-mediata delle piastrine. La fisiopatologia dell’ITP è complessa, ancora poco conosciuta e comprende alterazioni dell’immunità innata, dell’immunità acquisita e della megacariocitopoiesi, con la milza che gioca un ruolo fondamentale nella distruzione piastrinica. Nella risposta autoimmune, i linfociti T e i linfociti B giocano un ruolo fondamentale nella patogenesi della malattia. L’attivazione della sottopolazione linfocitaria T helper follicolare (T follicular helper cells; Tfh) provoca la stimolazione dei linfociti B a produrre anticorpi anti-piastrina oppure la attivazione di una specifica sottopolazione di linfociti T CD8+ è in grado di indurre la lisi delle piastrine. Recentemente, le nuove tecniche di sequenziamento RNA-seq consentono l’analisi su singola cellula consentono del trascrittoma, del profilo immunologico e l’identificazione di cellule rare da popolazioni eterogenee. Scopo dello studio Lo scopo di questo studio è stato di mettere a punto la tecnologia RNA-seq su singola cellula (scRNA-Seq) per l’analisi del trascrittoma e del profilo immunologico delle popolazioni linfocitarie T e B in pazienti affetti da ITP. Materiali e metodi. Sono stati reclutati 4 pazienti affetti da ITP presso l’ Unità di Ematologia e Immunologia Clinica-Azienda Ospedaliera di Padova e 4 soggetti volontari non affetti da ITP. Dal prelievo di sangue, sono stati isolati i linfociti T e B mediante selezione negativa con biglie magnetiche. La quantità e la purezza dei linfociti è stata determinata, rispettivamente, mediante il conta cellule e la citofluorimetria. La partizione di singole cellule e il barcoding è stato eseguito mediante la piattaforma 10X Genomic Chromium IX. Le librerie sono state costruite nella regione 5’ linfocitaria e nella regione variabile 5’ dei linfociti T (TCR) e dei linfociti B (BCR). Il sequenziamento NGS è stato eseguito mediante piattaforma Nova-Seq 6000-Illumina. L’analisi bioinformatica è stata eseguita mediante il software Cell Ranger e CLC Genomics. Risultati . I controlli di qualità ottenuti dal sequenziamento NGS mostrano una ottima performance della corsa con uno score di Q30 vicino al 90%. La prima parte dell’analisi bioinformatica ha evidenziato che circa 10.000 cellule per campione sono state esaminate per lo studio del profilo trascrizionale e cellulare. Conclusione I risultati ottenuti dimostrano che la tecnologia scRNA-Seq permette l'analisi approfondita dell'espressione genica e della funzionalità della cellula, della progressione della malattia e della possibile efficacia terapeutica nei pazienti affetti da ITP.
Studio delle popolazioni linfocitarie T e B nella trombocitopenia autoimmune: un approccio RNA-Seq su singola cellula
CAMPISANI, MARCELLA
2023/2024
Abstract
Introduzione: La trombocitopenia immune (ITP) è una rara malattia ematologica acquisita, caratterizzata dalla distruzione immuno-mediata delle piastrine. La fisiopatologia dell’ITP è complessa, ancora poco conosciuta e comprende alterazioni dell’immunità innata, dell’immunità acquisita e della megacariocitopoiesi, con la milza che gioca un ruolo fondamentale nella distruzione piastrinica. Nella risposta autoimmune, i linfociti T e i linfociti B giocano un ruolo fondamentale nella patogenesi della malattia. L’attivazione della sottopolazione linfocitaria T helper follicolare (T follicular helper cells; Tfh) provoca la stimolazione dei linfociti B a produrre anticorpi anti-piastrina oppure la attivazione di una specifica sottopolazione di linfociti T CD8+ è in grado di indurre la lisi delle piastrine. Recentemente, le nuove tecniche di sequenziamento RNA-seq consentono l’analisi su singola cellula consentono del trascrittoma, del profilo immunologico e l’identificazione di cellule rare da popolazioni eterogenee. Scopo dello studio Lo scopo di questo studio è stato di mettere a punto la tecnologia RNA-seq su singola cellula (scRNA-Seq) per l’analisi del trascrittoma e del profilo immunologico delle popolazioni linfocitarie T e B in pazienti affetti da ITP. Materiali e metodi. Sono stati reclutati 4 pazienti affetti da ITP presso l’ Unità di Ematologia e Immunologia Clinica-Azienda Ospedaliera di Padova e 4 soggetti volontari non affetti da ITP. Dal prelievo di sangue, sono stati isolati i linfociti T e B mediante selezione negativa con biglie magnetiche. La quantità e la purezza dei linfociti è stata determinata, rispettivamente, mediante il conta cellule e la citofluorimetria. La partizione di singole cellule e il barcoding è stato eseguito mediante la piattaforma 10X Genomic Chromium IX. Le librerie sono state costruite nella regione 5’ linfocitaria e nella regione variabile 5’ dei linfociti T (TCR) e dei linfociti B (BCR). Il sequenziamento NGS è stato eseguito mediante piattaforma Nova-Seq 6000-Illumina. L’analisi bioinformatica è stata eseguita mediante il software Cell Ranger e CLC Genomics. Risultati . I controlli di qualità ottenuti dal sequenziamento NGS mostrano una ottima performance della corsa con uno score di Q30 vicino al 90%. La prima parte dell’analisi bioinformatica ha evidenziato che circa 10.000 cellule per campione sono state esaminate per lo studio del profilo trascrizionale e cellulare. Conclusione I risultati ottenuti dimostrano che la tecnologia scRNA-Seq permette l'analisi approfondita dell'espressione genica e della funzionalità della cellula, della progressione della malattia e della possibile efficacia terapeutica nei pazienti affetti da ITP.File | Dimensione | Formato | |
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https://hdl.handle.net/20.500.12608/80591