Synthetic lethality-based approach to uncover BAG3-related vulnerabilities in Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common malignant brain tumor in adults. It represents one of the most aggressive malignancies, characterized by high invasiveness and poor prognosis, with a median survival of approximately 15 months. Despite the multimodal therapy, long-term survival is rare, since many patients develop drug resistance to Temozolomide. For this reason, new therapeutical strategies are urgently needed. The Bcl2-associated athanogene 3 (BAG3) protein belongs to the BAG protein family, consisting of six members mainly involved in protein homeostasis acting as Hsp70 co-chaperones. However, BAG3 also modulates several cellular functions, including apoptosis, autophagy, cell adhesion and migration. BAG3 indeed has been found to be overexpressed in several tumors including GBM, where it enhances tumour resistance to therapy promoting cell survival, thus making BAG3 a promising therapeutical target. This work aimed to identify BAG3-related vulnerabilities through a drug repositioning, exploiting a synthetic lethality approach. To this purpose, a BAG3-KO GBM cell line has been used as in vitro tool and subjected to a High-Throughput drug Screening (HTS) with a library of more than 3500 drugs. Two different drug classes, BAG3-WT selective drugs and BAG3-KO selective drugs, have been identified displaying opposite activity. Among the first class, 7 compounds were particularly selective on BAG3-WT cells. Particularly, we identified multiple Polo-Like Kinase 1 (PLK1) inhibitors, highlighting an exclusive BAG3- dependent drug sensitivity explained by the loss of PLK1 expression in the absence of BAG3. On the other hand, we identified 9 BAG3-KO selective drugs targeting multiple intracellular pathways hence corroborating the unmet need of developing new BAG3 inhibitors. Of particular interest, we demonstrated for the first time that the absence of BAG3 sensitize cancer cells to ferroptotic cell death, thus revealing a fundamental role of BAG3 in ferroptosis resistance. To conclude, this work substantiates that our approach represents a robust tool to identify gene- related vulnerabilities, and it can be exploited to reveal new therapeutic targets in BAG3 highly expressing tumors, as well as to identify synthetic lethal gene pairs.

Il glioblastoma multiforme è il tumore cerebrale maligno più comune negli adulti e rappresenta una delle neoplasie più aggressive. È caratterizzato da alta invasività e da una prognosi infausta, con aspettativa di vita media di approssimativamente 15 mesi. Nonostante un approccio terapeutico multimodale, la sopravvivenza a lungo termine è rara in quanto molti pazienti sviluppano resistenza alla Temozolomide. Questo evidenzia l’urgente necessità di nuove strategie terapeutiche. La proteina Bcl2-associated athanogene 3 (BAG3) appartiene alla famiglia delle proteine BAG, un gruppo di sei membri coinvolti principalmente nell’omeostasi proteica agendo come co-chaperoni della proteina Hsp70. Tuttavia, BAG3 modula anche diverse funzioni cellulari, tra cui apoptosi, autofagia, adesione e migrazione cellulare. BAG3 risulta essere sovra espresso in diversi tumori tra cui il GBM, dove favorisce la resistenza tumorale alla terapia promuovendo la sopravvivenza cellulare, rendendo così BAG3 un promettente bersaglio terapeutico. L’obiettivo di questo lavoro era quello di identificare vulnerabilità correlate a BAG3 attraverso un riposizionamento farmacologico, sfruttando l’approccio di synthetic lethality. A tal fine è stata utilizzata una linea cellulare di glioblastoma BAG3-KO come modello in vitro, sottoposta a un High-Throughput Screening (HTS) farmacologico con una libreria di oltre 3500 farmaci. Sono state identificate due classi di farmaci con attività opposta, ovvero farmaci selettivi per la linea BAG3- WT e farmaci selettivi per la linea BAG3-KO. Tra la prima classe, 7 composti si sono rivelati particolarmente selettivi per le cellule BAG3-WT. In particolare, abbiamo identificato diversi inibitori della Polo-Like Kinase 1 (PLK1), evidenziando una sensibilità a questi farmaci esclusivamente dipendente da BAG3, spiegabile dalla perdita di espressione di PLK1 in assenza di BAG3. Al contrario, sono stati individuati 9 farmaci selettivi per BAG3-KO che bersagliano molteplici vie di segnale intracellulari, sostenendo così l'esigenza di sviluppare nuovi inibitori di BAG3. Di particolare interesse, abbiamo dimostrato per la prima volta che l'assenza di BAG3 sensibilizza le cellule tumorali alla morte cellulare ferroptotica, rivelando così un ruolo fondamentale di BAG3 nella resistenza alla ferroptosi. Per concludere, questo lavoro dimostra che il nostro approccio rappresenta uno strumento efficace per identificare vulnerabilità associate ad un determinato gene, e può essere sfruttato sia per individuare nuovi bersagli terapeutici nei tumori con alta espressione di BAG3, sia per identificare coppie di geni targettabili in simultanea per indurre morte cellulare.