INIBIZIONE DELLA CHINASI DI ADESIONE FOCALE (FAK) NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA: IMPLICAZIONI PER NUOVE STRATEGIE TERAPEUTICHE

BACKGROUND Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) is a chronic lymphoproliferative disease characterized by the clonal accumulation of CD19+/CD5+/CD23+ B lymphocytes in peripheral blood, bone marrow, and secondary lymphoid tissues. The pathogenesis of CLL involves multiple pathological mechanisms, including dysregulation of apoptosis, aberrant signaling mediated by the B-cell receptor (BCR), and dysfunctions in tumor microenvironment interactions. The introduction of Bruton’s tyrosine kinase (BTK) inhibitors, such as Ibrutinib, Acalabrutinib, and Zanubrutinib, has significantly improved the prognosis of CLL patients. However, the emergence of resistance and severe side effects has limited the efficacy of these therapies, highlighting the need for alternative therapeutic approaches. In this context, focal adhesion kinase (FAK), a key protein in the regulation of cell migration and other essential cellular processes, represents a potential therapeutic target for CLL. AIM OF THE STUDY The primary aim of this study was to evaluate the effects of FAK inhibition on CLL cells using Defactinib, a FAK inhibitor previously demonstrated to be safe and effective in clinical trials for solid tumors. Given the significant role of FAK in the survival and migration of leukemic cells, we hypothesized that combining Defactinib with BTK inhibitors could enhance the cytotoxic effects of the latter, thus potentiating their antitumor activity in vitro. METHODS The activation and phosphorylation of FAK were analyzed by western blotting at various time points in leukemic cells obtained from patients undergoing in vivo Ibrutinib-based therapeutic regimens. The viability of leukemic cells was assessed by treating B lymphocytes isolated from CLL patients for 24 and 48 hours with Defactinib (5 µM), either alone or in combination with BTK inhibitors (Ibrutinib, Acalabrutinib, Zanubrutinib; 5 µM), using Annexin V/Propidium Iodide flow cytometry test and western blotting. These experiments were also replicated under co-culture conditions with stromal cells to evaluate the role of the microenvironment in protecting leukemic cells. The efficacy of Defactinib was also tested in cells from patients resistant to Ibrutinib or subjected to multiple lines of therapy, characterized by particularly aggressive forms of CLL. Previously obtained data from a proteomic analysis were re-examined, focusing on correlations between FAK activation (phosphorylation at Y397) and proteins regulating various cellular processes. RESULTS Our analysis highlighted that elevated phosphorylation of FAK at the Y397 activation site was associated with a "pro-migratory" phenotype in CLL cells. This correlation was particularly significant in patients with unmutated IGHV genes, associated with poor prognosis. Additionally, patients with 11q deletion, typically associated with lymph node involvement, exhibited significantly higher levels of activated FAK (FAK-Y397). We demonstrated that treatment with Defactinib effectively reduced FAK phosphorylation and activation at Y397, leading to a significant increase in apoptosis in leukemic cells. The combination of Defactinib with BTK inhibitors showed greater efficacy in inducing apoptosis. Furthermore, Defactinib overcame the protective effect of stromal cells on CLL cells. Finally, Defactinib showed significant efficacy in patients resistant to Ibrutinib or those subjected to multiple treatments. CONCLUSIONS CLL patients with elevated FAK activation levels exhibit a "pro-migratory" phenotype and higher disease aggressiveness, potentially counteracted using Defactinib, either alone or in combination with BTK inhibitors. Overall, these findings indicate that FAK represents a promising therapeutic target for the development of novel approaches to CLL treatment, including cases resistant to conventional therapies.

PRESUPPOSTI DELLO STUDIO La Leucemia Linfatica Cronica (LLC) è una malattia linfoproliferativa cronica caratterizzata dall’accumulo di linfociti B CD19+/CD5+/CD23+ nel sangue periferico, nel midollo osseo e nei tessuti linfoidi secondari. La patogenesi della LLC coinvolge diversi meccanismi patologici, tra cui la perdita del controllo dell’apoptosi, anomalie nei segnali mediati dal recettore delle cellule B (BCR) e disfunzioni nelle interazioni con il microambiente tumorale. L’introduzione degli inibitori della Bruton’s tyrosine kinase (BTK) ha migliorato significativamente la prognosi dei pazienti con LLC. Tuttavia, la comparsa di resistenza e di gravi effetti collaterali ha reso necessaria l’identificazione di nuovi approcci terapeutici. In questo contesto, la chinasi di adesione focale (FAK), una proteina chiave nella regolazione di numerosi processi cellulari, rappresenta un potenziale bersaglio terapeutico per la LLC. SCOPO DELLA TESI Lo scopo di questa tesi è stato quello di valutare gli effetti sulle cellule di LLC, di Defactinib, un inibitore di FAK già dimostratosi sicuro ed efficace in alcuni studi clinici su tumori solidi. Considerando il ruolo significativo di FAK nella sopravvivenza e nella migrazione delle cellule leucemiche, abbiamo ipotizzato che la combinazione di Defactinib ed inibitori di BTK potesse amplificare l’attività antitumorale in vitro di questi ultimi. MATERIALI E METODI L’attivazione e la fosforilazione di FAK sono state analizzate mediante western blotting, a diversi intervalli di tempo, nei linfociti B ottenuti da pazienti in terapia con Ibrutinib. La vitalità è stata valutata trattando i linfociti B isolati da pazienti con LLC per 24h e 48h con Defactinib (5μM), da solo o in combinazione con inibitori di BTK (5μM), tramite il test citofluorimetrico dell’Annessina V/Ioduro di Propidio e western blotting. Gli stessi esperimenti sono stati riprodotti in condizioni di co-coltura con cellule stromali per mimare il microambiente tumorale. L’efficacia di Defactinib è stata testata anche nelle cellule di pazienti resistenti ad Ibrutinib o precedentemente sottoposti a più linee di terapia. I dati ottenuti da una precedente analisi di proteomica sono stati riesaminati ponendo particolare attenzione alla correlazione tra l’attivazione di FAK (fosforilazione in Y397) e proteine regolatrici di diversi processi cellulari. RISULTATI La nostra analisi ha messo in evidenza come un’elevata fosforilazione di FAK al sito attivatorio Y397 fosse associata ad un fenotipo “pro-migratorio” delle cellule di LLC. In particolare, questa correlazione risultava più significativa nei pazienti con geni IGHV non mutati, a prognosi sfavorevole. Inoltre, in quei pazienti presentanti la delezione 11q, tipicamente associati ad un coinvolgimento linfonodale, abbiamo riscontrato livelli significativamente più alti di FAK attivata (FAK-Y397). Abbiamo dimostrato che il trattamento con Defactinib era in grado di ridurre la fosforilazione, e quindi l’attivazione, di FAK-Y397, inducendo un aumento significativo dell’apoptosi nelle cellule leucemiche. La combinazione di Defactinib con inibitori di BTK ha mostrato un effetto maggiore nell’indurre apoptosi. Inoltre, il trattamento con Defactinib era in grado di bypassare la protezione fornita dalle cellule stromali alle cellule di LLC. Infine, Defactinib ha mostrato un’efficacia significativa anche nei pazienti resistenti a Ibrutinib o sottoposti a molteplici trattamenti. CONCLUSIONI I pazienti con LLC caratterizzati da elevati livelli di attivazione di FAK presentano un fenotipo “pro-migratorio” ed una maggiore aggressività della malattia potenzialmente contrastabile con l’utilizzo di Defactinib, da solo o in combinazione con gli inibitori di BTK. Complessivamente, questi risultati indicano come FAK sia un promettente bersaglio per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici contro la LLC.