Isolamento e caratterizzazione di vescicole extracellulari da emolinfa di vongola verace (Ruditapes philippinarum)

The Manila clam (Ruditapes philippinarum) is one of the most consumed fish species in the world and it has an important commercial value. Besides this, this animal is a filter feeder and it tends to accumulate a lot of particles suspended in water, such as heavy metals, drugs, pollutants and nanoparticles. In addition, climate change (such as global warming and acidification of water) impacts their metabolism, their immune response and their survival. All considered, the study of this specie can provide useful information about the effects of pollution and global warming on marine species, allowing also to obtain precious information about food safety and the safety of the environment, in order to respect the concept of One Health. Extracellular vesicles (EV) are small vesicles surrounded by a membrane which are delivered by every cell type. They are abundant in every type of body fluid and they carry useful information about the cell from which they origin. They play an important role in many physiologic and pathologic processes but they have also a diagnostic, prognostic and therapeutic role. For this reason, in human Medicine studies on EVs are abundant whereas much rarer and preliminary in veterinary Medicine. In particular, to date there is no research focused on the study of EVs in Ruditapes philippinarum. For this reason and to deepen the knowledge on the subject in this specie, in this thesis a protocol to isolate and characterize EVs was created, starting from the hemolymph of the Manila clam. EVs were isolated combining ultrafiltration, Size Exclusion Chromatography and ultracentrifugation and were characterized by Nanoparticle Tracking Analysis (NTA), proteins’ quantification and Western Blot analysis (WB). Thanks to the first method, the concentration of the solutions and an estimate of the particles’ dimensions were obtained, the latter compatible with those of EVs. The proteins’ quantification method, on the other hand, gave the solution’s protein concentration and the results obtained allowed to understand that most of the particles measured through NTA were EVs. Finally, through analysis of Western Blot we incubated various mammalian antibody (CD9, β-actin, enolase, TSG101 e integrin-β); only integrin-β gave back a faint positivity. In conclusion, even if other analysis is required in order to further characterize clams’ EVs, to evaluate if other mammalian antibodies are capable of reacting with Manila clam’s antigens and to try and standardize isolation and characterization’s techniques, here we describe for the first time EVs’ presence in Manila clam’s hemolymph, by presenting a potential isolation protocol but shedding also light on the difficulties of isolating and characterizing EVs form bivalves’ hemolymph.

La vongola verace (Ruditapes philippinarum) è una delle specie ittiche più consumate nel mondo e ha un importante valore commerciale. Oltre a questo, è un animale filtratore che tende ad accumulare molti dei materiali presenti in acqua, inclusi metalli pesanti, farmaci, composti inquinanti e nanoplastiche. In aggiunta, le conseguenze del cambiamento climatico (quali l’innalzamento delle temperature e l’acidificazione delle acque) hanno un impatto sul loro metabolismo, sulla loro risposta immunitaria e sulla loro sopravvivenza. Ciò considerato, lo studio di questa specie può fornire utili informazioni riguardo agli effetti dell’inquinamento e del riscaldamento globale sulle specie marine, permettendo di ottenere preziose informazioni riguardo la salubrità degli alimenti e dell’ambiente nel concetto di One Health. Le vescicole extracellulari (VE) sono delle vescicole circondate da membrana che vengono rilasciate da tutti i tipi cellulari. Sono rinvenibili in tutti i fluidi corporei e portano importanti informazioni sulla cellula di origine. Hanno un importante ruolo in moltissimi processi fisiologici e patologici e pertanto possono essere utilizzate anche a scopo diagnostico, prognostico e terapeutico. Per questo motivo, in Medicina umana gli studi a riguardo sono abbondanti, più scarsi e preliminari ma comunque in crescita anche quelli in Medicina veterinaria. In particolare, ad oggi non vi sono studi centrati sull’analisi delle VE in Ruditapes philippinarum. Con lo scopo di approfondire le conoscenze riguardo le VE in questa specie, in questa tesi di laurea si è creato un protocollo per isolare e caratterizzare le VE a partire da emolinfa di vongola. Le VE sono state isolate combinando ultrafiltrazione, Size Exclusion Chromatography e ultracentrifuga e caratterizzate tramite Nanoparticle Tracking Analysis (NTA), quantificazione proteica e analisi di Western Blot (WB). Con la prima metodica si sono ottenute le concentrazioni delle diverse soluzioni e una stima delle dimensioni delle particelle presenti, che sono risultate compatibili con quelle delle VE. Il metodo di quantificazione proteica, invece, ha restituito le concentrazioni proteiche delle soluzioni contenenti vescicole e i risultati ottenuti hanno permesso di dedurre che la gran parte delle particelle misurate all’NTA siano VE. Infine, tramite WB si è provato ad incubare diversi anticorpi di mammifero (CD9, β-actina, enolasi, TSG101 e integrina-β); di questi, solamente l’integrina-β ha restituito una lieve positività. In conclusione, nonostante ulteriori studi siano necessari per caratterizzare ulteriormente le VE di vongola, per valutare se altri anticorpi di mammifero sono in grado di cross-reagire con gli antigeni di vongola verace e per tentare di standardizzare i metodi di isolamento e caratterizzazione, qui descriviamo per la prima volta la presenza di VE nell’emolinfa della vongola verace, riportando un possibile protocollo di isolamento ma mettendo anche in luce le difficoltà dell’isolamento e della caratterizzazione delle VE da emolinfa di bivalvi.