Assessing the Reliability of Herpesvirus Detection in Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Cetacean Tissues Using Immunohistochemistry and PCR

Cetaceans are susceptible to Alpha- and Gammaherpesviruses, pathogens that may increase mortality and the risk of stranding. Despite growing reports of herpesvirus infections, reliable forensic detection methods for these viruses in cetaceans remain unvalidated. This study aimed to assess a herpesvirus (HV) detection protocol based on the methodology proposed by Sierra et al. (2022), using 36 formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissues from eight bottlenose dolphins (Tur siops truncatus), two striped dolphins (Stenella coeruleoalba), and one fin whale (Balaenoptera physalus), deemed herpesvirus-positive based on PCR analyses performed on frozen tissue/FTA cards. Immunohistochemistry (IHC) was performed with a rabbit polyclonal HSV1 antibody (1:75, ab9533, Abcam, RRID: AB_307320), using an EnVision FLEX Mini Kit (GV823, Dako Omnis). A PCR-positive mediastinal lymph node from a striped dolphin served as a positive control, and blanks were used to verify secondary antibody specificity. Furthermore, DNA was extracted from 25 of the IHC-tested tissue samples, chosen between those previously reported to contain herpesviruses by PCR on frozen tissue/FTA cards or IHC, using two different commercial kits (Qiagen AllPrep® DNA/RNA FFPE Kit and Macherey-Nagel NucleoSpin® DNA FFPE XS) and analysed via pan-herpesvirus nested PCR (VanDevanter et al., 1996). Real-Time PCR targeting the GAPDH gene as an internal control was employed to evaluate DNA extraction. IHC revealed immunoreactivity in five animals in lymphoid tissue, CNS, liver, spleen, kidney, heart, and other tissues, consistent with previous reports. However, nested PCR failed to detect herpesvirus DNA in all the selected samples, despite successful DNA extraction confirmed by Real-Time PCR. These findings suggest that DNA extraction from FFPE tissues is not adequate to validate HSV1 antibodies in cetaceans, possibly owing to nucleic acid degradation, biomolecular assay sensitivity and focality. Further research employing alternative approaches, such as in situ hybridization and cetacean virus-specific primers, is warranted to enhance herpesvirus detection in cetacean FFPE tissues.

I cetacei sono suscettibili ad Alfa- e Gammaherpesvirus, patogeni che possono aumentare la mortalità e il rischio di spiaggiamento. Nonostante le crescenti segnalazioni di infezioni da herpesvirus, rimangono non validate metodiche affidabili di rilevamento forense di questi virus nei cetacei. Questo studio ha avuto l’obiettivo di valutare un protocollo di rilevamento degli herpesvirus (HV) basato sulla metodologia proposta da Sierra et al. (2022), utilizzando 36 campioni di tessuto inclusi in paraffina e fissati in formalina (FFPE) provenienti da otto tursiopi (Tursiops truncatus), due stenelle striate (Stenella coeruleoalba) e una balenottera comune (Balaenoptera physalus), ritenuti positivi agli herpesvirus sulla base di analisi PCR effettuate su tessuti congelati o su FTA card. Un’analisi immunoistochimica (IHC) è stata eseguita utilizzando un anticorpo policlonale di coniglio anti-HSV1 (1:75, ab9533, Abcam, RRID: AB_307320), impiegando un kit EnVision FLEX Mini (GV823, Dako Omnis). Un linfonodo mediastinico PCR-positivo proveniente da una stenella striata è stato utilizzato come controllo positivo, mentre dei blank sono stati impiegati per verificare la specificità dell’anticorpo secondario. Inoltre, da 25 dei campioni testati in IHC, selezionati tra quelli precedentemente segnalati come positivi agli herpesvirus mediante PCR effettuata su tessuto congelato/FTA cards o IHC, è stato estratto DNA utilizzando due kit commerciali differenti (Qiagen AllPrep® DNA/RNA FFPE Kit e Macherey-Nagel NucleoSpin® DNA FFPE XS) e analizzato tramite pan-herpesvirus nested PCR (VanDevanter et al., 1996). Una Real-Time PCR mirata al gene GAPDH è stata utilizzata come controllo interno per valutare l’efficacia dell’estrazione del DNA. L’IHC ha rivelato immunoreattività in cinque animali a livello di tessuti linfoidi, sistema nervoso centrale, fegato, milza, rene, cuore e altri tessuti, in linea con quanto riportato in letteratura. Tuttavia, la nested PCR non ha rilevato DNA di herpesvirus in nessuno dei campioni selezionati, nonostante l’estrazione del DNA sia risultata efficace secondo la Real-Time PCR. Questi risultati suggeriscono che l’estrazione di DNA da tessuti FFPE non è adeguata per validare l’uso di anticorpi anti-HSV1 nei cetacei, probabilmente a causa della degradazione degli acidi nucleici, della focalità delle lesioni e della sensibilità dei test biomolecolari. Ulteriori studi che impieghino approcci alternativi, come in situ hybridization e primer specifici per virus dei cetacei, sono auspicabili per migliorare la rilevazione degli herpesvirus nei tessuti FFPE di cetacei.