Sviluppo e validazione di un sistema automatizzato per l’estrazione e l’amplificazione real time PCR di acidi nucleici

La diagnostica molecolare si occupa della rilevazione di patogeni virali e batterici nel campo delle malattie infettive, della genetica e dell’oncologia. Tra le tecniche più utilizzate vi è la real time PCR (dall’inglese Polymerase Chain Reaction, ossia reazione a catena della polimerasi) che consente di rilevare la presenza di un patogeno tramite l’estrazione e l’isolamento del materiale genetico da un campione biologico. L’automazione di questi processi è fondamentale per rispondere ad una domanda di analisi sempre più in crescita, basti pensare a quanto accaduto con la pandemia di COVID-19 che ha portato ad un aumento esponenziale della richiesta di tamponi molecolari. Inoltre, consente di ridurre i tempi di esecuzione, standardizzare la procedura riducendo così l’errore umano e aumentando l’efficienza, migliorare l’integrazione con i sistemi informativi di laboratorio (LIS) e aumentare la sicurezza per gli operatori. In questo contesto, il presente elaborato, frutto di un tirocinio curriculare della durata di sei mesi presso l’azienda AB Analitica Srl con sede in Padova, si propone l’obiettivo di descrivere un sistema automatizzato sample-to-result (dal campione al risultato) per l’estrazione e l’amplificazione real time PCR di acidi nucleici da campioni biologici di diversa matrice (sangue, plasma, urina, liquor). Dopo un’introduzione dedicata alla reazione a catena della polimerasi (PCR) e, in modo specifico, alla real time PCR, viene presentato lo strumento sample-to-result GENEQUALITY® 2050, illustrandone i principali componenti e il processo di funzionamento, con un approfondimento sul sistema di computer vision in grado di guidare l’operatore nelle varie fasi di allestimento. Successivamente viene descritta l’elaborazione del segnale di fluorescenza di amplificazione tramite il software AB Genius Report®, finalizzata alla rilevazione dell’eventuale presenza del patogeno ricercato e, se necessario, alla sua quantificazione. Infine, vengono presentati due algoritmi impiegati nell’elaborazione del segnale, utilizzati per il calcolo della baseline, ovvero del segnale rilevato nelle prime fasi dell’amplificazione, e della threshold, ovvero la soglia oltre la quale un campione può considerarsi positivo alla presenza del patogeno.