Targeting MYB80 for the induction of male sterility in Cichorium spp.: a protoplast-based genome editing approach

This thesis investigates the potential of a DNA-free genome editing approach, based on CRISPR/Cas technology, to induce male sterility in species of the Cichorium genus. This group includes economically valuable crops such as chicory (C. intybus) and endive (C. endivia), and represents an excellent model for studying the genetic and molecular mechanisms underlying reproductive barriers. Notably, the genus encompasses both self-incompatible species, like chicory, and self-compatible ones, like endive, making it particularly suitable for research aimed at understanding and manipulating reproductive traits for breeding purposes. Along with these traits, male sterility plays a crucial role in improving hybrid seed production in horticulture, since it facilitates the exploitation of heterosis (hybrid vigor), often resulting in higher yields and improved quality in hybrid varieties. The use of genome editing to generate male sterile lines, especially through DNA-free methods, is of great interest since it bypasses the integration of foreign DNA, thus avoiding classification of edited plants as genetically modified organisms (GMOs). In this study, pre-assembled ribonucleoprotein (RNP) complexes were employed. These are composed of the Cas9 nuclease and single guide RNAs (sgRNAs) specifically designed to target the MYB80 gene—a well-characterized gene involved in the induction of male sterility in several model species such as Arabidopsis thaliana, and in important crops like rice. A central objective of this work was the development of an optimized experimental platform capable of supporting protoplast isolation, PEG-mediated transfection, and subsequent plant regeneration. The high sensitivity of Cichorium protoplasts to PEG-mediated transformation confirmed their potential as effective systems for DNA-free gene editing. The improvement of efficient transient transformation protocols, flexible encapsulation methods, and successful regeneration outcomes reinforces the value of CRISPR-based applications via protoplasts in chicory and endive. The experimental workflow was structured into several main phases. First, specific sgRNAs were designed using bioinformatic tools such as CRISPOR, to identify specific genomic regions within the MYB80 gene to be targeted with minimal off-target effects. Second, the activity and specificity of the RNP complexes were validated in vitro by analyzing their ability to cleave MYB80 gene fragments pre-amplified by PCR assay, confirming the functional integrity of the Cas9-gRNA complexes designed in this thesis work. Third, optimized protocols for protoplast isolation and transfection were applied to both C. intybus and C. endivia, ensuring high cell viability and efficient uptake of in vitro pre-assembled RNP complexes, two criteria necessary for downstream applications. Finally, callus proliferation and shoot regeneration were achieved by cultivating the transfected protoplasts on media optimized for supporting morphogenic development. In parallel with this main part of the study, the morphogenic potential of callus tissues, derived from each transfection condition, was also evaluated under varying concentrations of plant growth regulators, mainly auxins and cytokinins. The findings allowed the identification of the optimal hormonal balances needed to maintain callus tissue, stimulate root formation, and promote shoot regeneration—key steps toward establishing a reproducible in vitro regeneration system for the species under investigation. In conclusion, this study represents an initial yet pivotal step toward the development of male sterile lines in Cichorium spp. through DNA-free CRISPR-based genome editing. Moreover, it offers valuable insights into the hormonal regulation of in vitro plant morphogenesis, laying a solid foundation for future advancements in plant biotechnology and in plant breeding.

Questo lavoro di tesi si focalizza sull'applicazione di un sistema di genome editing privo di DNA, mediante CRISPR/Cas, per ottenere la sterilità maschile in alcune specie del genere Cichorium. Tale genere comprende specie di grande interesse economico, come la cicoria (C. intybus) e l’indivia (C. endivia), modelli ideali per lo studio dei meccanismi genetici e molecolari delle barriere riproduttive. Poiché il genere Cichorium comprende sia specie autoincompatibili, come la cicoria, sia specie autocompatibili, come l’indivia, risulta particolarmente adatto a ricerche sulla comprensione e manipolazione dei caratteri riproduttivi per il miglioramento genetico. La sterilità maschile riveste un ruolo fondamentale nel miglioramento della produzione di semi ibridi, poiché favorisce lo sfruttamento dell'eterosi (vigore ibrido), portando spesso a rese più elevate e qualità superiore delle varietà ibride. L’applicazione del genome editing per ottenere linee sterili maschili, soprattutto tramite metodiche DNA-free, è di particolare interesse poiché evita l’integrazione di sequenze esogene, prevenendo la classificazione delle piante editate come OGM. A tal fine, questo lavoro ha impiegato complessi ribonucleoproteici (RNP) preassemblati, composti dalla nucleasi Cas9 e da RNA guida (gRNA) progettati per riconoscere il gene MYB80, noto per il suo ruolo nell’induzione della sterilità maschile in diverse specie modello (es. Arabidopsis thaliana) e colture agrarie di rilievo, come il riso. Uno degli obiettivi principali è stato lo sviluppo di una piattaforma sperimentale ottimizzata, in grado di supportare l’isolamento dei protoplasti, la trasfezione mediata da PEG e la successiva rigenerazione delle piante, per future applicazioni di approcci DNA-free nel miglioramento genetico del genere Cichorium. L’ottimizzazione dei protocolli di trasformazione transiente, il perfezionamento delle tecniche di incapsulamento e i primi risultati positivi in termini di rigenerazione confermano il potenziale della tecnologia CRISPR via protoplasti sia in cicoria sia in indivia. Il lavoro sperimentale è stato articolato in più fasi: (i) progettazione di gRNA mirati tramite strumenti bioinformatici come CRISPOR, per identificare regioni specifiche del gene MYB80 minimizzando effetti off target; (ii) validazione in vitro dell’attività e della specificità dei complessi RNP, tramite la loro capacità di riconoscere e tagliare frammenti specifici del gene MYB80; (iii) applicazione di protocolli ottimizzati per isolamento e trasfezione dei protoplasti in C. intybus e C. endivia, ottenendo alta vitalità cellulare e efficiente internalizzazione dei RNP; (iv) proliferazione dei calli e rigenerazione dei germogli, coltivando i protoplasti trasfettati in terreni ottimizzati per sostenere lo sviluppo morfogenetico. Parallelamente, è stato valutato il potenziale morfogenetico dei tessuti callosi derivati da ciascuna condizione di trasfezione, sottoposti a diverse concentrazioni di regolatori della crescita, principalmente auxine e citochinine. I risultati hanno permesso di individuare i rapporti ormonali più favorevoli al mantenimento del callo, alla formazione delle radici e alla rigenerazione dei germogli, passaggi essenziali per stabilire un sistema di rigenerazione in vitro riproducibile per le specie studiate. In conclusione, questo lavoro rappresenta un primo passo verso lo sviluppo di linee sterili maschili in Cichorium spp. tramite genome editing CRISPR privo di DNA. Inoltre, offre contributi rilevanti alla comprensione della regolazione ormonale della morfogenesi vegetale in vitro, ponendo basi solide per futuri progressi nella biotecnologia vegetale e nelle strategie di miglioramento genetico.