Utilizzo di un reporter splitGFP per seguire il destino intracellulare di molecole di RNA esogeno veicolate in modelli cellulari 2D e 3D

Lo sviluppo di nuovi ed efficienti metodi di veicolazione di mRNA è un aspetto centrale per il progresso e l’evoluzione delle tecnologie che utilizzano molecole di RNA in ambito terapeutico. Il mio elaborato di tesi verte sull’utilizzo di una sonda ricombinante per valutare la veicolazione di molecole di mRNA inserite all’interno di diverse piattaforme e la loro efficienza di traduzione. Tale sonda sfrutta la tecnologia basata sulla proteina fluorescente SplitGFP. Questa è una proteina fluorescente verde costituita da 2 porzioni: GFP 1-10 e β11. Questi due frammenti, quando sono separati non sono fluorescenti, ma se si vengono a trovare in prossimità sono in grado di complementare e generare una proteina che emette fluorescenza nel verde. Nella tesi sono stati utilizzati metodi di delivery diversi: sia la trasfezione con la lipofectamina che con le nanoparticelle lipidiche. L’obiettivo era mettere a punto le condizioni migliori di incubazione con le nanoparticelle lipidiche e paragonare la loro efficienza nel trasportare l’mRNA messaggero di interesse all’interno della cellula. L’mRNA codificante la porzione β11, che rappresenta il nostro mRNA di interesse, è stato quindi caricato sulle nanoparticelle lipidiche a diversi livelli di concentrazione. Le nanoparticelle sono state incubate in diverse linee cellulari che esprimevano già la porzione GFP 1-10 della sonda e l’efficienza di complementazione è stata valutata al microcopio confocale. Si è anche cercato capire se con questo sistema fossimo in grado di misurare la veicolazione di mRNA in una struttura tridimensionale; quindi, abbiamo sfruttato la capacità delle cellule HeLa di formare sferoidi: aggregati di cellule, che si associano in condizioni diverse, specifiche per ogni linea cellulare. In futuro prevediamo di applicare questi sistemi anche in cellule IPSC (Induced Pluripotent Stem Cell) che possono essere differenziate in base alle necessità e per questo rappresentano un modello molto versatile per la valutazione dei sistemi di veicolazione dell’mRNA in tipi cellulari diversi.