Introduzione alla biologia strutturale mediante cryo-elettro microscopia (cryo-EM): principi, applicazioni e analisi dati su complessi proteici di interesse farmacologico

This thesis describes general aspects on cryo-EM technique and discusses its applications by defining three-dimensional structures of proteins of pharmacological interest. The principles underlying transmission electron microscopy are presented following a presentation of the phases and related techniques involved in single-particle analysis studies, such as production of the protein of interest, sample optimization, deposition on the support, data acquisition and analysis. The cryo-SPARC data analysis software is then described, which was used to produce structural models of the T20S Proteasome, Complex I of the mitochondrial respiratory chain, and ACAD9. In conclusion, this technique proves to be highly versatile and can be used to gain insights into a wide variety of particles and their conformational states.

In questa tesi viene approfondita la tecnica cryo-EM e se ne dimostrano le applicazioni attraverso la determinazione della mappa tridimensionale di proteine di interesse farmacologico. Una volta delucidati i principi alla base della microscopia elettronica a trasmissione (TEM), sono descritte le caratteristiche specifiche della cryo-EM. Successivamente vengono presentate le fasi e relative tecniche coinvolte in studi di single particle analysis, ovvero la produzione della proteina d’interesse, l'ottimizzazione del campione, deposizione sul supporto, acquisizione ed analisi dei dati. Viene descritto il programma di data analysis cryo-SPARC, il quale è stato utilizzato per produrre i modelli strutturali del Proteasoma T20S, del Complesso I della catena respiratoria mitocondriale e di ACAD9. In conclusione, questa tecnica si conferma molto versatile, e può essere utilizzata per acquisire conoscenza di una grande varietà di particelle e relativi stati conformazionali.