Screening di Zebrafish mutanti per il gene RRM2B ottenuti mediante l'approccio CRISPR/Cas9

La ribonucleotide reduttasi (RNR) è l’enzima chiave della sintesi de novo dei precursori del DNA, catalizzando la riduzione dei ribonucleotidi difosfato (NDPs) nei corrispondenti deossinucleotidi difosfato (dNDPs). La sua subunità alternativa RRM2B è necessaria per il mantenimento del DNA mitocondriale nelle cellule post- mitotiche. Mutazioni nel gene RRM2B sono la causa di una grave encefalomiopatia umana caratterizzata da deplezioni di DNA mitocondriale in diversi tessuti. Questa tesi si propone di studiare gli effetti delle mutazioni di questo gene nell’organismo modello zebrafish, attraverso la generazione di linee mutanti mediante la tecnologia CRISPR/Cas9. I mutanti sono stati generati partendo da cellule uovo fecondate in cui è stato microiniettato il tool di editing (generazione parentale F0). Gli individui adulti sono stati poi incrociati con pesci wild-type ottenendo così la generazione filiale F1. L’identificazione dei mutanti è stata effettuata tramite elettroforesi su gel di agarosio. La natura delle mutazioni verrà successivamente approfondita mediante sequenziamento Sanger. I mutanti rrm2b consentiranno di valutare in vivo l’impatto della mutazione durante lo sviluppo embrionale e nei tessuti ad alto fabbisogno energetico, nei quali la deplezione di mtDNA compromette la produzione di ATP. Inoltre, questo modello sperimentale può contribuire a chiarire i meccanismi patogenetici e l’individuazione di strategie terapeutiche.