Saggio in vitro per la validazione di mutazioni di splicing associate a patologia nell'uomo

Lo splicing è il processo responsabile della maturazione degli mRNA eucariotici, attraverso la rimozione degli introni e l’unione degli esoni e può essere alterato da vari tipi di mutazioni. Esse possono essere localizzate sia negli esoni sia nelle regioni introniche e possono portare alla comparsa di nuovi siti di splicing o alla distruzione di siti già esistenti. Gli effetti conseguenti variano dallo skipping di uno o più esoni all’anomala inclusione di introni o di porzioni di essi. L’effetto di una mutazione sul processo di splicing può essere valutato tramite il saggio funzionale del minigene, consistente in un vettore di espressione eucariotica contenente una porzione di un gene di riferimento, come la β-globina, all’interno del quale viene clonata la regione genomica che comprende la variante di interesse. Dopo la trasfezione transiente del costrutto generato in colture cellulari umane e l’estrazione del RNA, si esegue l’analisi e il confronto dei pattern di splicing dei trascritti, wild - type e mutato, tramite RT-PCR e sequenziamento del cDNA ottenuto.