Clonaggio ed espressione in E. coli della porzione N-terminale del recettore di membrana Flagellin-Sensitive 2 di A. thaliana

Grazie ai progressi delle tecniche di manipolazione del DNA, oggi è possibile far esprimere proteine in organismi eterologhi, facilitando la produzione e lo studio di questa ampia classe di biomolecole. Malgrado ciò, a causa delle caratteristiche strutturali e di una elevata eterogeneità, le proteine di membrana richiedono particolari protocolli caso-specifici per ottimizzare la loro sintesi in sistemi ospiti. In questo tirocinio si è andati ad ingegnerizzare un vettore di espressione commerciale, tramite passaggi successivi di mutagenesi sito-specifica, con il fine di esprimere, in E. coli, un costrutto di fusione con una porzione di un recettore di membrana di A. thaliana. Il nuovo vettore d'espressione è stato assemblato attraverso tecniche di restrizione, defosforilazione e ligazione, mentre i passaggi di verifica sono stati eseguiti attraverso PCR e corse elettroforetiche. Il plasmide ultimato è stato utilizzato per trasformare un ceppo di E. coli, adatto all’espressione di proteine eterologhe. In conclusione, è stata eseguita un’analisi dell’espressione del prodotto di fusione mediante Western Blot, che ha evidenziato la difficoltà del suo mantenimento in forma completa all’interno dell’organismo. Nonostante ciò, i risultati ottenuti rappresentano comunque un punto di partenza per lo sviluppo di strategie alternative volte al miglioramento dell’espressione della porzione proteica di interesse.