Analisi metabolomica mediante Risonanza Magnetica Nucleare ¹H per l'identificazione di biomarcatori associati alla subfertilità nelle vacche da latte

This thesis is part of a broader research project entitled “Use of hormones in dairy cow reproduction: when are they truly necessary? Automatic monitoring systems and biological markers for precision reproductive management”, funded by PRIN 2022. The overall objective of the project is to promote a more sustainable approach to reproductive management in dairy cows by significantly reducing the unnecessary use of hormonal treatments. Specifically, the project aims to limit hormonal interventions only to animals with actual fertility issues, using a precision farming approach based on the early identification of subfertile cows through biological markers and advanced monitoring technologies. The experimental activities described in this work were carried out at two farms involved in the project: the Experimental Teaching Farm of the Department of Veterinary Medical Sciences, University of Bologna (Ozzano dell’Emilia, BO), and the Allevamento Martin Agricultural Company (Rocca Santa Maria, TE). Blood samples were collected at both locations following a standardized protocol, with the goal of identifying biomarkers associated with subfertility. Postpartum cows were randomly and blindly assigned to two different reproductive protocols: the SYNCH protocol (Double Ovsynch), which includes hormonal synchronization, and the PREC protocol, which is based on natural estrus detection and excludes routine hormonal treatments. Pregnancy diagnosis was performed by the farm veterinarian at 40 ± 2 days post-artificial insemination (AI) using transrectal ultrasonography. Blood samples were collected at five key time points: 21 days before calving, 10 days after calving, 35 days after calving, at the time of first AI, and, if necessary, at the time of second AI. These samples underwent proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (¹H-NMR) to identify potential discriminant metabolites between fertile (F) and subfertile (SF) cows. My role in the project focuses on conducting the metabolomic analysis aimed at exploring differences in metabolic profiles between fertile and subfertile animals. Through the application of multivariate statistical techniques, particularly Principal Component Analysis (PCA) and Partial Least Squares Discriminant Analysis (PLS-DA), the objective is to identify distinctive metabolic patterns potentially linked to subfertility status. Early identification of such profiles could represent a valuable diagnostic tool in the context of precision reproduction, contributing to a more targeted and efficient fertility management strategy in dairy farming.

L’elaborato si inserisce all'interno di un progetto di ricerca più ampio intitolato “Utilizzo degli ormoni nella riproduzione delle vacche da latte: quando sono veramente necessari? Sistemi di monitoraggio automatico e marcatori biologici per una gestione riproduttiva di precisione”, finanziato con fondi PRIN 2022. L’obiettivo generale del progetto è promuovere una gestione riproduttiva più sostenibile nelle bovine da latte, riducendo l’uso non necessario di trattamenti ormonali. In particolare, si mira a limitare l’impiego degli ormoni solo agli animali che presentano reali problemi di fertilità, adottando un approccio di agricoltura di precisione basato sull'identificazione precoce delle bovine subfertili mediante marcatori biologici e tecnologie di monitoraggio avanzate. L'attività sperimentale descritta in questo elaborato si è svolta presso due aziende coinvolte nel progetto: la Stalla Didattica Sperimentale del Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie dell’Università di Bologna (Ozzano dell’Emilia, BO) e la Società Agricola Allevamento Martin (Rocca Santa Maria, TE). In entrambe le strutture sono stati effettuati campionamenti di sangue secondo protocolli definiti, con l’obiettivo di individuare biomarcatori associati a stati di subfertilità. Le vacche in post-parto sono state suddivise casualmente e assegnate in modo cieco a due protocolli riproduttivi differenti: il protocollo SYNCH (Double Ovsynch), che prevede l’uso di ormoni per sincronizzare l’ovulazione, e il protocollo PREC, che si basa invece sull’identificazione del calore naturale, escludendo quindi il trattamento ormonale sistematico. La diagnosi di gravidanza è stata eseguita mediante ecografia transrettale dal veterinario aziendale a 40 ± 2 giorni dall’inseminazione artificiale (IA). I campioni di sangue sono stati raccolti in cinque momenti chiave: 21 giorni prima del parto, 10 giorni dopo il parto, 35 giorni dopo il parto, in corrispondenza della prima IA e, se necessario, in occasione della seconda IA. Su tali campioni è stata condotta un’analisi metabolomica tramite spettroscopia di risonanza magnetica nucleare al protone (¹H-NMR), con l’intento di identificare eventuali metaboliti discriminanti tra bovine fertili (F) e subfertili (SF). Il mio contributo all’interno di questo progetto consiste nella conduzione dell’analisi metabolomica finalizzata all’esplorazione di possibili differenze nei profili metabolici tra i due gruppi di animali. Attraverso l'applicazione di tecniche di statistica multivariata, in particolare l’analisi delle componenti principali (PCA) e l’analisi discriminante parziale dei minimi quadrati (PLS-DA), si intende evidenziare pattern metabolici distintivi e potenzialmente associati a condizioni di subfertilità. L’identificazione precoce di questi profili potrebbe rappresentare un importante strumento diagnostico nell’ambito della riproduzione di precisione, contribuendo a una gestione più mirata ed efficiente della fertilità nelle aziende da latte.