Clinicopathological Study of Mitochondrial DNA Deletion Syndromes and Development of a Novel RNAscope Method for Mapping Intrafiber Heteroplasmy

Mitochondrial diseases caused by single large-scale deletions of mitochondrial DNA (mtDNA) represent a heterogeneous clinical spectrum, ranging from progressive external ophthalmoplegia to multisystem disorders. In this thesis, we retrospectively analyzed a cohort of patients with single mtDNA deletions followed at the University of Padova. Clinical data were systematically collected to characterize the signs and symptoms associated with mitochondrial disease. Histological analyses on skeletal muscle biopsies were performed using standard staining methods, including NADH, SDH, COX, modified Gomori trichrome, Oil Red O, and combined COX-SDH. Molecular analyses on skeletal muscle tissue were conducted to confirm the presence and characteristics of mtDNA deletions. Statistical analyses were then applied to investigate the relationship between histopathological severity and clinical disease progression. In addition, we developed an innovative protocol based on RNAscope technology, adapted to detect mtDNA in situ. This method was first optimized in cybrid models and wild-type cells, with the goal of applying it to patient tissues to achieve spatial visualization of deleted versus wild-type mtDNA within single cells. This combined clinical, histological, molecular, and methodological approach provides new insights into the pathophysiology of single-deletion mitochondrial disorders and contributes to the development of advanced diagnostic tools.

Le malattie mitocondriali causate da ampie delezioni singole del DNA mitocondriale (mtDNA) rappresentano uno spettro clinico eterogeneo, che varia dall’oftalmoplegia esterna progressiva a quadri multisistemici complessi. In questa tesi è stata condotta un’analisi retrospettiva di una coorte di pazienti con delezioni singole di mtDNA seguiti presso l’Università di Padova. I dati clinici sono stati raccolti in modo sistematico al fine di caratterizzare i segni e i sintomi associati alla malattia mitocondriale. Sono state eseguite analisi istologiche su biopsie muscolari scheletriche mediante metodiche di colorazione standard, tra cui NADH, SDH, COX, tricromica di Gomori modificata, Oil Red O e la combinazione COX-SDH. Analisi molecolari sul tessuto muscolare sono state inoltre condotte per confermare la presenza e le caratteristiche delle delezioni di mtDNA. Successivamente, sono state applicate analisi statistiche per indagare la relazione tra gravità istopatologica e progressione clinica della malattia. Inoltre, è stato sviluppato un protocollo innovativo basato sulla tecnologia RNAscope, adattato per rilevare il mtDNA in situ. Tale metodo è stato inizialmente ottimizzato in modelli cybrid e in cellule wild-type, con l’obiettivo di applicarlo a tessuti di pazienti al fine di ottenere una visualizzazione spaziale del mtDNA delezionato rispetto a quello wild-type all’interno delle singole cellule. Questo approccio integrato clinico, istologico e molecolare ha l'intento di porre nuove prospettive sulla fisiopatologia delle malattie mitocondriali da delezione singola e contribuisce allo sviluppo di nuove frontiere nello studio delle biospie muscolari.