IL RUOLO DELLE VESCICOLE EXTRACELLULARI NELLA PATOLOGIA DI FABRY

1.Summary Introduction Fabry disease is an X-linked inherited metabolic disorder caused by mutations in the GLA gene. These genetic alterations lead to reduced or absent activity of the α-galactosidase A enzyme, resulting in the accumulation of glycosphingolipids, particularly globotriaosylceramide (Gb3), within the cell lysosomes. This toxic Gb3 buildup causes cellular abnormalities and organ dysfunction, with a significant impact on the cardiac, renal, and nervous systems. At the same time, scientific literature has recently highlighted the crucial role of exosomes, small extracellular vesicles (EVs), in mediating intercellular communication and modulating numerous biological processes, ranging from immune system regulation and autophagy to the progression of various diseases. Aim of the Study This study aims to evaluate the activity of exosomes derived from patients with Fabry disease, to clarify their role in the progression and spread of the disease. Specifically, we want to assess their effects on autophagy in the HEK293 (Human Embryonic Kidney) renal cell line, given that the kidney is one of the most affected organs in the disease. Materials and Methods Urinary EVs were isolated and characterized by ultracentrifugation and cytofluorimetry from 10 adult patients with Fabry disease (6 males and 4 females) and 8 healthy controls (5 males and 3 females). Renal cells (HEK293) were incubated with the same amount of EVs for 48 and 72 hours. Subsequently, autophagic flux was assessed by measuring p62 protein expression and the LC3-II/LC3-I ratio using Western blotting and densitometric analysis. Results The results show that, after 72 hours of incubating HEK293 cells with vesicles isolated from Fabry patients, there was a significant increase in the LC3-II/LC3-I ratio (% mean protein expression relative to healthy controls at 48 hours: 86 ± 32, p=0.154; % mean protein expression relative to healthy controls at 72 hours: 152 ± 47, p<0.05) and in the p62 substrate (% mean protein expression relative to healthy controls at 48 hours: 89 ± 18, p=0.227; % mean protein expression relative to healthy controls at 72 hours: 132 ± 28, p<0.05). Conclusion These results suggest a potential role for EVs in influencing cellular processes and thereby promoting the diffusion and progression of Fabry disease. Further research is needed to fully understand the underlying molecular mechanisms, evaluate the long-term implications of exosomal interactions, and validate the in vitro data with in vivo studies.

1. Riassunto Introduzione La Malattia di Fabry è un disordine metabolico ereditario legato al cromosoma X, risultante da mutazioni a carico del gene GLA. Queste alterazioni genetiche determinano una ridotta o assente attività dell'enzima α-galattosidasi A, con conseguente accumulo di glicosfingolipidi, in particolare del globotriaosilceramide (Gb3), all'interno dei lisosomi delle cellule. Questo accumulo tossico di Gb3 provoca anomalie cellulari e disfunzioni d'organo, con un impatto significativo sul sistema cardiaco, renale e nervoso. Parallelamente, la letteratura scientifica ha recentemente evidenziato come gli esosomi, piccole vescicole extracellulari (VE), svolgano un ruolo cruciale nella mediazione intercellulare e nella modulazione di numerosi processi biologici, che spaziano dalla regolazione del sistema immunitario e dell’autofagia fino alla progressione di numerose patologie. Scopo dello studio Questo studio si propone di valutare l’attività delle vescicole extracellulari (VE) derivate da pazienti affetti dalla malattia di Fabry, al fine di chiarire il loro ruolo nella progressione e diffusione della patologia. In particolare, si vogliono analizzare gli effetti che essi hanno sull’autofagia nella linea cellulare embrionale renale HEK293 (Human Embryonic Kidney), in considerazione del fatto che il rene rappresenta uno degli organi maggiormente colpiti dalle manifestazioni cliniche della malattia. Materiali e Metodi Le Vescicole Extracellulari urinarie sono state isolate e caratterizzate tramite ultracentrifugazione e citofluorimetria da 10 pazienti adulti affetti da Malattia di Fabry (AFD) (6 maschi e 4 femmine) e da 8 controlli sani (5 maschi e 3 femmine) . Delle cellule renali (HEK293) sono state incubate con la stessa quantità di vescicole per 48 e 72 ore. Successivamente, il flusso autofagico è stato valutato misurando l'espressione delle proteine p62 e il rapporto LC3-II/LC3-I mediante Western blotting e analisi densitometrica. Risultati I risultati mostrano, dopo 72 ore di incubazione delle cellule HEK293 con le vescicole isolate da pazienti con Fabry, un aumento significativo del rapporto di LC3-II/LC3-I (% di espressione media della proteina rispetto ai controlli sani a 48 ore: 86 ± 32, p=0,154; % di espressione media della proteina rispetto ai controlli sani a 72 ore: 152 ± 47, p<0,05) e del substrato p62 (% di espressione media della proteina rispetto ai controlli sani a 48 ore: 89 ± 18, p=0,227; % di espressione media della proteina rispetto ai controlli sani a 72 ore: 132 ± 28, p<0,05) Conclusioni Questi risultati suggeriscono un ruolo potenziale delle VE nell’influenzare i processi cellulari e favorire così la diffusione e la progressione della patologia di Fabry. Sono necessarie ulteriori ricerche per comprendere appieno i meccanismi molecolari sottostanti, valutare implicazioni a lungo termine e convalidare i dati ottenuti in vitro mediante studi in vivo.