Ottimizzazione di un protocollo di differenziamento di cellule staminali embrionali umane (hESCs) in cardiomiociti

Introduction: Cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) represent valuable models for studying cardiac diseases and for advanced therapies. The development of efficient and reproducible differentiation protocols is therefore of fundamental importance. Among the most recent, the protocol based on the modulation of the Wnt/β-catenin pathway has been described as particularly effective, albeit with some limitations. Thus, optimization of the protocol to allow the generation of an adequate quantity of human cardiomyocytes is crucial for experimental applications. Materials and Methods: Cardiomyocytes were differentiated from human embryonic stem cells (hESCs, H9 line), following a protocol that involves the activation and subsequent inhibition of the Wnt/β-catenin pathway, using CHIR99021 and IWP2, respectively. To improve the yield and efficiency of differentiation, the effects of insulin and prolonged activation of the Wnt pathway were tested with different initial cell concentrations. Cardiomyocytes were selected based on their metabolic characteristics, through culture in a glucose-free medium enriched with lactate, and finally characterized using Real-time RT-PCR and indirect immunofluorescence techniques. Results: The reference differentiation protocol allowed for the generation of cardiomyocytes, but with an insufficient overall yield. The variations introduced optimized the differentiation efficiency, enabling the formation of extensive networks of contractile cells. However, the various replicates performed indicate that reproducibility was not yet optimal. The expression of specific cardiac markers confirmed the transition of stem cells towards a cardiac phenotype. Conclusions: The results obtained confirm that the modifications made to the reference protocol can improve differentiation efficiency. Further studies will be necessary to increase its reproducibility, in order to produce large stocks of cardiomyocytes.

Introduzione: I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) rappresentano utili modelli per lo studio delle malattie cardiache e per terapie avanzate. La messa a punto di protocolli di differenziamento efficienti e riproducibili riveste dunque un’importanza fondamentale. Tra i più recenti, quello basato sulla modulazione del pathway Wnt/β-catenina è stato descritto come particolarmente efficace, pur presentando alcune limitazioni. Pertanto un’ottimizzazione del protocollo che consenta la generazione una quantità adeguata di cardiomiociti umani risulta fondamentale per le applicazioni sperimentali. Materiali e metodi: I cardiomiociti sono stati differenziati da cellule staminali embrionali umane (hESCs, linea H9), seguendo un protocollo che prevede l’attivazione e successiva inibizione del pathway Wnt/β-catenina, rispettivamente mediante CHIR99021 e IWP2. Per il miglioramento della resa e dell’efficienza di differenziamento, sono stati testati gli effetti dell’insulina e del prolungamento dell’attivazione del pathway Wnt con diverse concentrazioni cellulari di partenza. I cardiomiociti sono stati selezionati sfruttandone le caratteristiche metaboliche, tramite coltura in un mezzo privo di glucosio e arricchito con lattato e infine caratterizzati mediante tecniche di Real-time PCR e immunofluorescenza indiretta. Risultati: Il protocollo di differenziamento di riferimento ha consentito la generazione di cardiomiociti, ma con una resa complessiva insufficiente. Le variazioni apportate hanno ottimizzato l’efficienza di differenziamento, consentendo la formazione di ampie reti di cellule contrattili. Tuttavia, le diverse repliche effettuate indicano una riproducibilità non ancora ottimale. L’espressione di specifici marcatori cardiaci ha confermato la transizione delle cellule staminali verso un fenotipo cardiaco. Conclusioni: I risultati ottenuti confermano che le modifiche apportate al protocollo di riferimento possono migliorare l’efficienza di differenziamento. Ulteriori studi saranno necessari per incrementarne la riproducibilità, al fine di produrre ampi stock di cardiomiociti.