Stima dell'imprecisione di due metodi analitici diagnostici basati su tecnologia PCR Real Time e applicati alla diagnostica oncoematologica

Introduzione: La Real Time PCR quantitativa (qPCR, PCR quantitativa in tempo reale) è una tecnica fondamentale nella diagnostica molecolare che permette di rilevare e misurare con precisione specifiche sequenze di DNA o RNA. Rispetto alla PCR tradizionale, monitora l’amplificazione in tempo reale grazie a segnali fluorescenti, consentendo quantificazioni affidabili e riproducibili. Questa tecnologia è ampiamente utilizzata nello studio delle neoplasie mieloproliferative. Nelle forme Philadelphia-positive, come la leucemia mieloide cronica, il monitoraggio del trascritto BCR-ABL1 tramite RT-qPCR guida la valutazione della risposta terapeutica ai farmaci inibitori della tirosin-chinasi. Nelle forme Philadelphia-negative, come policitemia vera, trombocitemia essenziale e mielofibrosi primaria, la qPCR permette di rilevare mutazioni chiave come JAK2 V617F, utili per la diagnosi e il supporto nella gestione clinica dei pazienti. Scopo: Il presente elaborato si propone di stimare l’imprecisione analitica derivante da vari fattori, tra cui lotti di reagenti, operatori e sedute sperimentali, in due metodi analitici diagnostici basati sulla tecnologia PCR Real Time ed utilizzati per la rilevazione e quantificazione delle principali mutazioni genetiche nelle neoplasie mieloproliferative, in particolare la traslocazione BCR-ABL1 e la mutazione puntiforme JAK2 V617F L’obiettivo finale è di valutare, mediante la stima dell’imprecisione, l’efficienza delle reazioni, la ripetibilità e la riproducibilità dei risultati.. Materiali e Metodi: Sono stati analizzati campioni di sangue periferico di pazienti con sospetto o diagnosi confermata di MPN. L’RNA è stato estratto manualmente dal buffy coat mediante colonnine di silice ed è stato utilizzato per la ricerca del trascritto BCR-ABL1 mediante RT-qPCR, utilizzando il gene ABL come controllo interno. Il DNA genomico, invece, è stato estratto in maniera automatizzata da sangue intero mediante biglie magnetiche ed è stato analizzato per la mutazione JAK2 V617F mediante qPCR. Tutte le analisi sono state condotte utilizzando kit CE-IVD, includendo controlli positivi e negativi, standard di calibrazione e analisi in duplicato. Risultati: Tra gennaio e luglio 2025 sono state eseguite 18 sedute per il trascritto p210 BCR-ABL1 e 16 sedute per la mutazione V617F del gene JAK2 tramite RT-qPCR e qPCR. Per entrambi i target sono stati valutati la ripetibilità intra-seduta e la riproducibilità inter-seduta, analizzando i valori di Ct degli standard, i parametri delle curve di calibrazione (slope, intercetta, coefficiente di determinazione R²) e l’efficienza delle reazioni. Le analisi hanno evidenziato buona stabilità e linearità delle curve di calibrazione, con deviazioni standard e coefficienti di variazione generalmente contenuti, confermando la precisione delle misurazioni. L’efficienza di amplificazione è risultata compresa tra 92% e 101% per BCR-ABL1 e tra 83% e 99% per JAK2, con valori medi prossimi al 97–94%, indicando reazioni affidabili e riproducibili. Per entrambi i target, la maggiore variabilità è stata osservata negli standard a bassa frequenza allelica, presenti in quantità molto ridotta nei campioni, mentre gli standard a concentrazione più alta risultano stabili e coerenti. L’analisi della variabilità legata agli operatori e ai lotti di reagenti non ha evidenziato differenze significative, dimostrando la robustezza del metodo e la coerenza dei dati tra sedute, operatori e diversi lotti di standard, sia per il target BCR-ABL1 sia per JAK2. Conclusioni: I risultati confermano che le metodiche qPCR utilizzate per BCR-ABL1 p210, ABL1 e JAK2 V617F/WT sono robuste, riproducibili e conformi agli standard internazionali. La maggiore variabilità osservata negli standard a basse copie e, in particolare, nel punto a bassa frequenza allelica del target mutato V617F era attesa e non compromette la validità diagnostica.