VALIDAZIONE DI UN SAGGIO DI COMPREHENSIVE GENOMIC PROFILING PER LA PROFILAZIONE MOLECOLARE ESTESA DI UNA COORTE DI COLANGIOCARCINOMI INTRAEPATICI

Introduzione: Il colangiocarcinoma intraepatico (iCCA) è una rara neoplasia epatica che insorge nei dotti biliari di secondo ordine e costituisce il 10-20% di tutti i colangiocarcinomi. La profilazione molecolare dei colangiocarcinomi è fortemente consigliata dalle linee guida del gruppo di lavoro di ESMO sulla oncologia di precisione. Ad oggi le principali alterazioni trattabili con farmaci a bersaglio molecolare includono: mutazioni puntiformi a carico di IDH1 (8-18%) e riarrangiamenti del gene FGFR2 (5-15%). Mentre le mutazioni a carico di IDH1 si rilevano generalmente con metodiche NGS che utilizzano come templato il DNA o con real-time PCR, le fusioni a carico di FGFR2 richiedono l’impiego di metodiche NGS a RNA, o analisi FISH. Negli ultimi anni sono stati sviluppati pannelli NGS di comprehensive genomic profiling (CGP) che consentono di valutare fino a 500 geni driver, utilizzando come templato sia il DNA che l’RNA. Scopo: La seguente tesi si propone di testare un saggio CGP denominato AVENIO Tumor Tissue CGP Kit V2, in una selezione di 80 pazienti affetti da iCCA. Rispetto ad altri saggi, quello scelto si basa esclusivamente sul sequenziamento del DNA. Per tale motivo, sarà rivolta particolare attenzione alla valutazione della capacità del saggio di rilevare riarrangiamenti genici a carico del gene FGFR2, tradizionalmente rilevato attraverso NGS-RNA. Materiali e metodi: 102 campioni fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) ottenuti da pazienti sottoposti a intervento chirurgico per iCCA tra il 2012 e il 2024 sono stati selezionati all’interno di uno studio più ampio denominato ‘BITCOIN’. In seguito all’estrazione, i campioni di DNA sono stati valutati per determinare il grado di frammentazione del DNA. Solo i campioni con qualità (QC score) superiore a 0.02 sono stati utilizzati per la preparazione di librerie NGS. Il pannello consente la valutazione delle principali alterazioni genetiche in 335 geni driver, oltre a marcatori come lo status microsatellitare, il TMB e le alterazioni a carico dei processi di ricombinazione omologa (HRD). Dopo il sequenziamento, i dati sono analizzati utilizzando la piattaforma FoundationOne. Risultati: Un totale di 102 casi sono stati estratti, di questi l’10.8% presentava una resa inferiore a 2 ng/µl per cui sono stati esclusi prima di procedere alla valutazione della frammentazione. Mentre l’10.8% dei casi è stato escluso poiché risultava inadeguato alla preparazione della libreria presentando un valore di QC score inferiore a 0.02. L’11.8% dei casi presentava QC score compreso tra 0.02 e 0.04 (cut-off indicato dal produttore) tutti questi casi, pur essendo al di sotto del QC score, sono risultati comunque analizzabili. 58 casi sono stati valutati con almeno una metodica ortogonale (NGS-RNA o FISH) per la presenza di fusioni a carico di FGFR2. Nel complesso il pannello Avenio ha restituito risultati discrepanti rispetto ad almeno una delle altre metodiche ortogonali nel 5.2% dei casi. La profilazione ha inoltre, messo in evidenza alterazioni a carico di altri geni quali CDKN2A (33.7%), CDKN2B (28.7%), MTAP (20%), BAP1 (17.5%), ARID1A (13.7%), TP53 (13.7%), IDH1 (11.2%), IDH2 (6.2%), PBRM1 (6.2%) e PIK3CA (6.2%). Conclusioni: Il pannello AVENIO ha dimostrato buone performance, con circa 20% di campioni inadeguati all’analisi. I dati sono in linea con quanto riportato in letteratura, considerando che la coorte è costituita da campioni datati (2012-2024). Per quanto riguarda la concordanza nella valutazione dei riarrangiamenti a carico di FGFR2, se comparato con NGS-RNA, attualmente considerato la metodica gold-standard, il pannello in analisi non è stato in grado di rilevare la presenza del riarrangiamento genico in un solo caso. L’impiego di un pannello esteso ha inoltre, consentito di identificare nuove alterazioni genetiche a carico di geni driver, potenzialmente targettabili