Study of COQ8A and COQ8B complexes in human cells.

Primary Coenzyme Q (CoQ10) deficiencies are genetic disorders caused by pathogenic variants in CoQ10 biosynthesis genes. COQ8A (ADCK3) and COQ8B (ADCK4) are required for the synthesis of CoQ in human cells. It was reported that COQ8A is able to homodimerize through its intermembrane domain in vitro and aminoacids that participate at the dimerization interface of COQ8A are identical in COQ8B. However, whether COQ8A and COQ8B may form homo- and heterodimers in human cells has never been studied. With the aim of understanding the role of COQ8A and COQ8B expression ratio and homologous/heterologous interaction in the regulation of CoQ levels in human cells we have generated lentiviral vectors to express tagged versions of wild-type and missense mutants of COQ8A and COQ8B in HEK293 cells. Missense mutants found in patients or affecting residues in the Gly-zipper motif of the putative dimerization domain were transduced in HEK293 COQ8A and COQ8B knock-out cells and expression was checked by SDS-PAGE and western blot (WB). COQ8A and COQ8B variants were expressed at lower levels than wild-type cells. Then COQ8A and COQ8B mitochondrial complexes were studied by Blue Native-PAGE gel electrophoresis using mild detergents such as N-Dodecyl-Beta-D-Maltoside (DDM) and Digitonin. COQ8A and COQ8B were organized in several complexes, and some were shared by both COQ8 proteins, however, only COQ8A migrated at the predicted molecular weight for a dimer. COQ8A and COQ8B missense variants showed the same complexes as wild-type genes albeit at lower levels. Finally, COQ8A and COQ8B variants appear to exert different effects in total CoQ levels measured by HPLC. COQ8A variants seem to increase while COQ8B variants seem to decrease CoQ. Overall, these results suggest that COQ8A and COQ8B shared some mitochondrial complexes but not seem to heterodimerize in human cells, and that alterations in COQ8 complexes may correlate with the efficiency of CoQ biosynthesis.

Le carenze primarie di Coenzima Q (CoQ10) sono disturbi genetici causati da varianti patogene nei geni della biosintesi del CoQ10. COQ8A (ADCK3) e COQ8B (ADCK4) sono necessari per la sintesi del CoQ nelle cellule umane. È stato riportato che COQ8A è in grado di omodimerizzare attraverso il suo dominio intermembrana in vitro e che gli aminoacidi che partecipano all'interfaccia di dimerizzazione di COQ8A sono identici in COQ8B. Tuttavia, non è mai stato studiato se COQ8A e COQ8B possano formare omodimeri ed eterodimeri nelle cellule umane. Con l'obiettivo di comprendere il ruolo del rapporto di espressione di COQ8A e COQ8B e dell'interazione omologa/eterologa nella regolazione dei livelli di CoQ nelle cellule umane, abbiamo generato vettori lentivirali per esprimere versioni wild-type e mutanti missenso di COQ8A e COQ8B in cellule HEK293. I mutanti missenso riscontrati nei pazienti o che influenzano i residui nel motivo Gly-zipper del dominio di dimerizzazione putativo sono stati trasdotti in cellule HEK293 COQ8A e COQ8B knock-out e l'espressione è stata verificata mediante SDS-PAGE e western blot (WB). Le varianti di COQ8A e COQ8B si esprimono a livelli inferiori rispetto alle proteine wild-type. Successivamente, i complessi mitocondriali di COQ8A e COQ8B sono stati studiati mediante elettroforesi su gel Blue Native-PAGE utilizzando detergenti delicati come N-Dodecyl-Beta-D-Maltoside (DDM) e Digitonina. COQ8A e COQ8B si trovano organizzati in diversi complessi, alcuni dei quali condivisi da entrambe le proteine COQ8; tuttavia, solo COQ8A migrava al peso molecolare previsto per un dimero. Le varianti missenso di COQ8A e COQ8B hanno mostrato gli stessi complessi delle proteine wild-type, sebbene a livelli inferiori. Infine, le varianti COQ8A e COQ8B sembrano esercitare effetti diversi sui livelli totali di CoQ misurati mediante HPLC. Le varianti COQ8A sembrano aumentare il CoQ, mentre le varianti COQ8B sembrano diminuirlo. Nel complesso, questi risultati suggeriscono che COQ8A e COQ8B condividono alcuni complessi mitocondriali ma non sembrano eterodimerizzare nelle cellule umane, e che le alterazioni nei complessi COQ8 possono essere correlate all'efficienza della biosintesi del CoQ.