Sintesi e caratterizzazione di derivati della piocianina come potenziali modulatori del metabolismo mitocondriale

Mitochondrial diseases arise from impairments in the oxidative phosphorylation (OXPHOS), particularly involving complexes I and III of the respiratory chain. With a prevalence of 5-20 cases per 100,000 individuals, these disorders primarily affect the nervous system and muscles- tissues with the highest energy demands. Despite extensive research, no effective therapies are currently available to restore mitochondrial functions or halt the severe clinical progression leading to neurological decline and premature death. At present, patients receive only symptomatic treatments- such as creatine, CoQ10, L-carnitine and nicotinamide- which alleviate symptoms without repairing the defective electron transport chain. This thesis explores the search for a truly effective therapeutic option for patients with complexes I and III dysfunctions with a particular focus on pyocyanin (PYO), a secondary metabolite of Pseudomonas aeruginosa belonging to the class of redox cyclers. These molecules can accept electrons from endogenous donors (e.g., ubiquinol) and transfer them to corresponding acceptors (e.g., cytochrome c). Remarkably, in previous work, sub-μM concentrations of PYO restored motor functions and coordination in vivo in Ttc19 knockout and Ndufs4 deficiency models, both in the short and long term, without significant toxicity. Furthermore, PYO enhanced ATP production in mitochondria isolated from mouse models and cell lines harboring mutations in complex I (Ndufs4) and complex III (BCS1l, TTC19, LYRM7), while also stimulating mitochondrial biogenesis. This innovative strategy may represent a promising alternative to genetic approaches, with potential to provide tangible clinical benefits and improved survival. The experimental work described in this thesis investigated the chemical reactivity of PYO under different pH conditions and solvents, with the aim of designing and synthesizing novel prodrugs. Particular attention was given to the carbonyl oxygen of the phenazine ring, which was reduced and conjugated with various functional groups to evaluate their stability over time in diverse environments. The rationale for developing a prodrug through reversible protection of reduced PYO was to minimize side effects arising from its redox activity and to improve pharmacokinetics by enhancing bioavailability and prolonging its half-life in vivo. This strategy is especially relevant given that PYO, as a small molecule, undergoes rapid metabolism and renal excretion, while also generating reactive oxygen species (ROS). The results provided a comprehensive overview of PYO’s reactivity, elucidated through multiple analytical techniques including cyclic voltammetry and electron paramagnetic resonance. Based on these findings, three PYO analogues were synthetized, characterized, and evaluated. Their biological effects were subsequently tested in cell culture models, with a particular focus on ATP production and ROS generation, the latter representing a critical safety concern.

Le malattie mitocondriali sono dovute ad alterazioni della funzionalità della catena respiratoria, colpendo in particolare i complessi I e III della fosforilazione ossidativa. Queste patologie affliggono 5-20 persone ogni 100 000 nascite, danneggiando soprattutto il tessuto nervoso e quello muscolare, quelli che richiedono maggiore energia. Nonostante tanti anni di ricerca non esistono al giorno d’oggi trattamenti efficaci nel ripristinare le funzioni mitocondriali alterate e nel migliorare le difficili condizioni di vita che portano ad un progressivo deficit neurologico e a morte prematura. Attualmente i pazienti ricevono solamente palliativi come creatina, L-carnitina, coenzima Q10 e nicotinammide. Questi integratori sono in grado solamente di migliorare i sintomi delle disfunzioni mitocondriali, non riescono dunque a riparare la catena di trasporto degli elettroni. Questa tesi esplora la ricerca di un trattamento farmacologico per quei pazienti affetti da disfunzioni dei complessi I e III. Attenzione particolare è stata posta alla molecola piocianina, un metabolita secondario del batterio Pseudomonas aeruginosa facente parte della classe dei ciclatori redox. Queste sostanze sono capaci di ricevere elettroni da un donatore endogeno (es. l’ubichinolo) e donarli ad un corrispondente accettore (es. citocromo c). Importante far notare che, come mostrato da precedenti studi, concentrazioni sub-μM di piocianina sono state capaci di ripristinare le funzionalità motorie e di coordinazione in vivo in modelli Ttc19 knockout e mancanti della proteina Ndfus4. La piocianina ha inoltre dimostrato benefici nel breve e nel lungo termine, senza causare tossicità rilevanti. Studi condotti su questa molecola hanno altresì rilevato la sua capacità di aumento nella produzione di ATP nei mitocondri di modelli animali murini e in colture cellulari portanti differenti mutazioni, sia del complesso I (Ndfus4) sia del complesso III (BCS1L, TTC19, LYRM7), aumentando allo stesso tempo la biogenesi mitocondriale. Questo nuovo approccio potrebbe rappresentare un’alternativa alla terapia genetica, offrendo allo stesso tempo reali miglioramenti clinici e aumentando la speranza di vita. Il lavoro sperimentale descritto in questa tesi ha indagato la reattività della piocianina a diversi pH in differenti solventi, con l’obiettivo di disegnare e sintetizzare nuovi profarmaci. Attenzione particolare è stata posta all’ossigeno carbonilico dell’anello fenazinico che è stato ridotto e coniugato con diversi gruppi funzionali, per poi analizzarne le proprietà in varie condizioni a tempi crescenti. Il razionale dietro al design di un profarmaco mediante protezione reversibile della molecola nella sua forma ridotta, è stata pensata per evitare gli effetti collaterali della piocianina dovuti alla sua attività redox e per migliorarne la farmacocinetica, aumentandone la biodisponibilità mediante aumento dell’emivita in vitro. Questa strategia è di particolare importanza dato che la piocianina, essendo una piccola molecola, è sottoposta a forte escrezione ed è capace allo stesso tempo di generare una grande quantità di specie reattive dell’ossigeno (ROS). I risultati ottenuti hanno permesso di avere un’idea complessiva della reattività della piocianina, analizzandone le proprietà redox con differenti tecniche analitiche quali la voltammetria ciclica e la risonanza elettronica paramagnetica. Basandosi su queste scoperte, è stato poi possibile produrre tre analoghi, caratterizzarli e analizzarne le proprietà. Gli effetti biologici sono stati successivamente valutati in modelli cellulari, con una particolare attenzione alla produzione di ATP e generazione di ROS, questi ultimi rappresentanti un rischio per la sicurezza.