Interazione avidina-oligonucleotidi: studi di affinità e indagini preformulative di nuovi sistemi di drug delivery

La terapia genica e gli acidi nucleici terapeutici hanno introdotto, negli ultimi decenni, nuove opportunità per il trattamento di numerose patologie grazie alla loro capacità di modulare in modo mirato l’espressione genica. Sebbene molecole come ASO, siRNA e miRNA abbiano già raggiunto applicazioni cliniche, rimane una sfida centrale lo sviluppo di sistemi di delivery efficaci, in grado di superare problematiche come instabilità biologica, degradazione da nucleasi, immunogenicità, effetti off-target, scarso assorbimento e rilascio intracellulare. Questo lavoro di tesi esplora l’avidina come piattaforma per la formazione di nanoassemblati per il trasporto di acidi nucleici, ispirandosi al modello delle nanoparticelle ANANAS. L’avidina, oltre alla ben nota affinità per la biotina, può infatti legarsi direttamente agli acidi nucleici tramite interazioni elettrostatiche e non covalenti. In una prima fase è stata studiata l’interazione tra avidina e oligonucleotidi a corta sequenza, mediante due tecniche: spettrofluorimetria ed EMSA. L’analisi di diverse tipologie di sequenze, differenti per struttura, composizione, lunghezza e natura chimica ha restituito valori di Kd (∼10⁻⁷ M) che indicano un’interazione elevata e modulabile sia dalle caratteristiche della sequenza che dell’ambiente di assemblaggio (acqua rispetto a tampone fosfato a pH 7,4). La fase successiva del lavoro ha riguardato la formulazione e l’ottimizzazione di nanoassemblati in termini di stabilità e dimensione. Poiché gli assemblati risultavano instabili dopo diluizione, sono state valutate due strategie di stabilizzazione: un crosslinking aldeidico, molto efficace ma irreversibile, e una stabilizzazione reversibile tramite b-PEG(1 kDa)-SH, mediata dalla formazione di ponti disolfuro. Il crosslinking covalente ha garantito un’elevata robustezza ma risulta incompatibile con sistemi che richiedono rilascio del carico. La stabilizzazione con b-PEG1000SH ha migliorato la capacità dell’assemblato di trattenere l’oligonucleotide a seguito di diluizione, come evidenziato da analisi elettroforetiche, mentre la stabilità colloidale, valutata mediante DLS, è risultata fortemente dipendente dalla composizione dell’assemblato (rapporto avidina–oligonucleotide). L’aggiunta di PEG lineare (b-mPEG 5 kDa) ha ridotto l’aggregazione e le dimensioni delle particelle, ma gli assemblati restano altamente sensibili agli ambienti ionici, collassando rapidamente in presenza di fosfato. Questo lavoro chiarisce i parametri critici che regolano gli assemblati con avidina e indica la necessità di ulteriori modifiche ed ottimizzazioni per renderli meno eterogenei, più stabili, reversibili e funzionali in condizioni fisiologiche.