Studio comparativo di formulazioni caricate con redox cyclers per il trattamento di disfunzioni mitocondriali

Mitochondria represent the main source of energy for the cells. Energy is produced by five protein complexes located in the mitochondrial inner membrane and then stored in ATP molecules. Mitochondrial dysfunctions, caused by genetic defects, lead to a progressive loss of energy resulting in metabolic disorders. In particular, complex III plays a fundamental role for the correct mitochondrial functionality. Complex III defects result in the onset of severe pathologies such as myopathies and neurodegenerative dysfunctions leading in the worst cases to death. Some studies demonstrated how small molecules, known as redox cyclers, are able to restore mitochondrial complex III functionality by acting as electron carriers. Clinical application of these molecules, however, is limited by different factors such as their poor water solubility and rapid clearance from the organism. The aim of this project was to formulate delivery systems of these redox cyclers to allow a sustained and prolonged release with the reduction of the number of administrations. The first part of the work was based on a comparative study among different formulations produced according to different techniques: microfluidics and nano-precipitation. Firstly, polymeric and lipid nanoparticles loaded with a first redox cycler were produced but results were not satisfying in terms of amount of encapsulated drug. Therefore, the study shifted to the delivery of a second redox cycler. Polymeric nanoparticles were formulated using poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA) and PLGA conjugated with polyethylene glycol (PEG). Then, lipid nanoparticles such as niosomes and liposomes were obtained. To increase water solubility of the drug molecule, different types of cyclodextrins were also employed. All the systems were characterized to evaluate their size, PDI, ζ-potential and encapsulation efficiency of the drug. The most promising results were obtained for PLGA nanoparticles and niosomes, both formulated by microfluidic, as they showed the highest drug encapsulation. These two formulations were selected for further release and stability studies. Release studies conducted on selected systems showed a slower and more controlled drug release, compared to the free active molecule loaded in the same delivery system. Stability studies were then performed in order to evaluate particles behaviour over time. Both systems seem to be stable for at least two weeks. Future studies will focus on optimizing the loading of redox cyclers into nanoparticles by varying the composition of the formulations or instrument parameters to then evaluate their behaviour in vitro and in vivo.

I mitocondri rappresentano la principale fonte di energia per le cellule. L’energia viene prodotta grazie a cinque complessi proteici localizzati sulla membrana mitocondriale interna e successivamente immagazzinata sottoforma di ATP. Le disfunzioni mitocondriali, causate da difetti genetici, comportano una progressiva perdita di energia che si traduce nell’insorgenza di disordini metabolici. In particolare, il complesso III svolge un ruolo fondamentale per la corretta funzionalità mitocondriale; difetti di questo complesso determinano lo sviluppo di gravi patologie, quali miopatie e disfunzioni neurodegenerative, fino ad arrivare, nei casi peggiori, a morte precoce. Alcuni studi hanno dimostrato come piccole molecole, definite redox cyclers, siano in grado di ripristinare la funzionalità del complesso III mitocondriale fungendo da trasportatori di elettroni. L’applicazione clinica di queste piccole molecole, tuttavia, è limitata da diversi fattori, tra cui la scarsa solubilità in acqua e la rapida eliminazione dall’organismo. Lo scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di formulare sistemi di delivery di tali redox cyclers, per consentire un rilascio sostenuto e prolungato con riduzione del numero di somministrazioni. La prima parte del progetto ha previsto uno studio comparativo tra diverse formulazioni, prodotte sfruttando tecniche di microfluidica e nano-precipitazione. In un primo momento sono state formulate nanoparticelle polimeriche e lipidiche caricate con un primo redox cycler, che però non hanno prodotto risultati soddisfacenti in termini di quantità di farmaco caricato. Lo studio si è quindi concentrato sul direzionamento di un secondo redox cycler. Sono state formulate nanoparticelle polimeriche di acido poli(lattico-co-glicolico) (PLGA) e particelle di PLGA coniugate con poli-etilen-glicole (PEG). Sono state poi prodotte nanoparticelle lipidiche quali niosomi e liposomi. Per aumentare la solubilità in acqua della molecola attiva, sono stati inoltre impiegati diversi tipi di ciclodestrine. Tutti i sistemi particellari prodotti sono stati caratterizzati per determinarne la dimensione, l’indice di polidispersività (PDI), il potenziale-ζ e l’efficienza di incapsulamento del farmaco. I risultati più promettenti sono stati ottenuti con le particelle di PLGA e con i niosomi, entrambi formulati con microfluidica, che hanno mostrato i valori più elevati di farmaco caricato. Queste due formulazioni sono state selezionate per effettuare ulteriori studi di rilascio e di stabilità. Gli studi di rilascio condotti sui sistemi nanoparticellari selezionati hanno mostrato un rilascio del farmaco più lento e controllato rispetto a quello osservato per la sola molecola attiva caricata nel medesimo sistema di veicolazione. Sono stati poi condotti studi dimensionali per valutare la stabilità delle particelle nel tempo: entrambi i sistemi sembrano rimanere stabili per almeno due settimane. Studi futuri si concentreranno sull’ottimizzazione del caricamento di redox cyclers in sistemi nanoparticellari, variando la composizione delle formulazioni o i parametri strumentali e valutando successivamente il comportamento di questi sistemi in vitro ed in vivo.