Progettazione e sviluppo di una nuova strategia sintetica per la produzione di analoghi tienopirazolici dell’inibitore di OPA1 MYLS22

Mitochondria are essential organelles for life and death of the cell. First described as the “powerhouse of the cell”, due to their central role in ATP production, they also play a key role in Ca2+ signaling, metabolic regulation and programmed cell death. Mitochondrial dynamics, namely the continuous membrane shape changes, is involved in most of these processes. These structural rearrangements are tightly linked to cellular fate decisions. Mitochondrial cristae are folds of the inner mitochondrial membrane (IMM) physically separated from the intermembrane space (IMS) by narrow tubular junctions. The majority of cytochrome c is confined into this compartment. During apoptosis, mitochondria morphology and ultrastructure changes. Cristae remodel by widening their junctions, mobilizing cytochrome c to the intermembrane space rendering it available for the release to the cytosol where it initiates the caspase cascade. Optic Atrophy 1 (OPA1), a dynamin-related GTPase, is one of the key regulators of IMM morphology that participates in mitochondrial fusion and exerts tight control over cristae remodeling during apoptosis. Overexpression of OPA1 has been shown to inhibit cytochrome c release, thus interfering with the intrinsic apoptotic pathway. OPA1 has a deep clinical significance: it is among the eight prognosis-related genes that exhibit frequent amplification across multiple cancer types. Elevated levels of OPA1 correlate with cancer cells resistance to standard chemotherapy regimens, such as Cisplatin, Sorafenib and the BH3-mimetic Bcl-2 targeting Venetoclax, highlighting its relevance as a therapeutic target. Recently, the selective OPA1 inhibitor MYLS22 has been shown to suppress tumor growth and metastasis. The discovery of this small molecule set the basis for the development of second-generation OPA1 inhibitors, designed to overcome MYLS22 limitations, such as poor solubility and mediocre potency (EC50 ≈100 μM). Subsequent structure-activity relationship (SAR) analysis and virtual screening approaches led to the discovery of promising MYLS22 analogues (Opitors) with enhanced potency. In this framework, my thesis project focused on the synthesis of a third generation of MYLS22 analogues, with the aim of addressing its pharmacological shortcomings. By analyzing a structurally diverse compound library, I investigated the substitution of a particular, pendant phenyl group of the parent compound with different heteroaryl moieties, to evaluate their impact on the overall pharmacological synthetic strategy. I initially attempted a linear synthetic approach, starting from the desired heteroaryl portion of the molecule; however, this strategy proved inconclusive due to the unpredictable reactivity of this moiety, which was not compatible with the planned rationale. Consequently, I adopted a divergent strategy, focusing on the construction of a common backbone that could be subsequently functionalized with a panel of heteroaryl groups. This proved to be a valid way to synthesize a library of different MYLS22 related analogues with different heteroaryl moieties.

I mitocondri sono organelli fondamentali per la vita e per la morte della cellula. Inizialmente descritti come la “centrale energetica della cellula” per il loro ruolo centrale nella produzione di ATP, oggi sappiamo invece essere coinvolti anche in processi chiave come la segnalazione del calcio (Ca²⁺), la regolazione del metabolismo e la morte cellulare programmata. La dinamica mitocondriale, ovvero i continui cambiamenti di forma delle membrane, determina la maggior parte di questi meccanismi e concorre alle decisioni relative al destino della cellula. Le creste mitocondriali sono ripiegamenti della membrana interna (IMM), separati dallo spazio intermembrana (IMS) da sottili giunzioni tubulari. In questo compartimento si trova confinata la maggior parte del citocromo c. Durante l’apoptosi, la morfologia e l’ultrastruttura dei mitocondri si modifica: le creste si rimodellano allargando le giunzioni, permettendo così al citocromo c di raggiungere lo spazio intermembrana e di renderlo disponibile al rilascio nel citosol dove avvia la cascata delle caspasi. Un ruolo centrale in questo processo è svolto da Optic Atrophy 1 (OPA1), una GTPasi della famiglia delle dinamine che regola la morfologia della membrana interna. OPA1 è coinvolta nel processo di fusione mitocondriale e controlla in modo fine il rimodellamento delle creste durante l’apoptosi. È stato dimostrato che la sua sovraespressione inibisce il rilascio di citocromo c, ostacolando in questo modo l’apoptosi per via intrinseca. OPA1 riveste anche una profonda importanza clinica: è infatti uno degli otto geni prognostici che mostrano frequenti amplificazioni in diversi tipi di tumore. Livelli elevati di OPA1 si associano alla resistenza delle cellule tumorali a trattamenti chemioterapici standard, come Cisplatino, Sorafenib e a Venetoclax, molecola BH3-mimetica diretta contro Bcl-2, confermandone la rilevanza come potenziale bersaglio terapeutico. In questo contesto è stato sviluppato MYLS22, un inibitore specifico dell’attività GTPasica di OPA1, in grado di ridurre la crescita tumorale e lo sviluppo di metastasi. La scoperta di questa piccola molecola ha aperto la strada a una nuova generazione di inibitori di OPA1, progettati per superare i limiti di MYLS22, come la scarsa solubilità e una potenza solo moderata (EC50 ≈100 μM). Successive analisi di relazione struttura-attività (SAR) e approcci di virtual screening hanno portato all’identificazione di analoghi di MYLS22, denominati Opitors, che presentano potenza aumentata. Su queste basi si inserisce il mio progetto di tesi, che ha avuto come obiettivo la sintesi di analoghi di terza generazione di MYLS22 che ne migliorassero le proprietà farmacologiche. Analizzando una libreria di composti strutturalmente eterogenei, ho concentrato la sintesi sulla sostituzione di uno specifico gruppo fenile di MYLS22 con diversi sostituenti eteroarilici, così da valutarne l’impatto sul profilo farmacologico complessivo. In un primo momento ho tentato un approccio sintetico lineare, partendo direttamente dalla porzione eteroarilica della molecola. Questa strategia si è rivelata poco efficace a causa dell’imprevedibile reattività di tale porzione. Per questo motivo ho successivamente adottato un approccio divergente, incentrato sulla costruzione di uno scheletro comune da funzionalizzare in un secondo momento con differenti sostituenti eteroarilici. Questo si è dimostrato essere un metodo valido per la sintesi di una libreria di analoghi di MYLS22 presentanti diverse tipologie di sostituenti eteroarilici.