Analisi preliminare di nuovi copolimeri a blocchi per la veicolazione di mRNA a cellule presentanti l'antigene

Nell'ambito dei trattamenti oncologici, negli ultimi anni l'immunoterapia è emersa come approccio incoraggiante. Rispetto ai trattamenti tradizionali, questa non mira all'uccisione diretta delle cellule tumorali ma al potenziamento del sistema immunitario del paziente verso il loro riconoscimento e distruzione. All'interno di quest'ambito si distinguono diverse classi di trattamenti immunoterapici tra cui i vaccini genetici a base di mRNA. i vaccini hanno l'obbiettivo di indurre una risposta immunitaria contro antigeni associati al tumore, attraverso l'espressione dell'antigene tumorale all'interno delle cellule presentanti l'antigene e la successiva presentazione dello stesso ai linfociti T. Affinché l'mRNA sia efficacemente tradotto nella proteina antigenica d'interesse, è necessario un sistema di veicolazione capace di proteggerlo nell'ambiente extracellulare, favorire l'entrata nelle cellule bersaglio e rilasciarlo nel citoplasma. In questo ambito, vettori polimerici si sono dimostrati promettenti come sistemi di veicolazione per gli acidi nucleici. Il progetto di tesi ha riguardato l'analisi di nuovi sistemi polimerici per la veicolazione di mRNA a cellule presentanti l'antigene, consistenti in copolimeri a blocchi di differente lunghezza, costituiti da un blocco idrofilico mannosilato e un blocco a base di piperazina. Il segmento mannosilato è responsabile del direzionamento del sistema alle cellule presentanti l'antigene: in particolare, il sistema è direzionato verso le cellule dendritiche che esprimono il recettore per il Mannosio CD206. La piperazina, che costituisce l'unità funzionale del secondo blocco, è volta a favorire la complessazione dell'acido nucleico e la fuga endosomiale. Nel progetto sono stati analizzati i polimeri valutando l'influenza del numero di unità ripetitive di ogni blocco nella formazione dei poliplessi e nella loro efficacia di associazione e trasfezione cellulare. Mediante titolazione acido-base è stato possibile verificare l'idoneità dei polimeri per la complessazione di mRNA e la risposta pH-dipendente all'ambiente endosomiale tramite determinazione del pKa e della capacità di buffering. Sono stati eseguiti saggi di mobilità elettroforetica su gel con mRNA di lunghezza differente, per valutare la complessazione a diversi N/P ratio, definito come il rapporto tra cariche positive dei gruppi amminici (N) del polimero negative dei gruppi fosfato (P) dell'acido nucleico. E' stata così dimostrata coerenza nel comportamento di complessazione al variare della lunghezza dell'mRNA. Tramite test di elettroforesi su gel e analisi dimensionale con DLS, i tre polimeri più lunghi si sono dimostrati stabili per un tempo sufficiente sia nelle condizioni di stoccaggio a 4° che in condizioni fisiologiche a 37° in presenza di plasma. A seguito della caratterizzazione dei poliplessi, sono stati eseguiti differenti tesi in vitro per valutare la capacità di associazione e trasfezione cellulari. A questo scopo sono state utilizzate due linee cellulari, cellule ovariche di criceto (CHO) di tipo wild-type e CHO presentanti il recettore per il mannosio CD206. L'utilizzo di entrambe le linee cellulari ha permesso di determinare la selettività dei sistemi per la veicolazione direzionata dell'mRNA e l'efficacia nella sua traduzione.