Development of serum biomarker quantification assays for Duchenne Muscular Dystrophy

Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a severe X-linked neuromuscular disorder characterized by progressive muscle degeneration and weakness. The identification and quantification of circulating biomarkers represent a promising opportunity to improve disease monitoring, patient stratification, and the development of targeted therapies. This thesis aims to develop reliable and reproducible immunoassays for a selected panel of candidate biomarkers relevant to DMD. The work is based on the use of the Suspension Bead Array (SBA) platform, a high-throughput multiplex technology that enables the simultaneous detection of multiple analytes in small volumes of human serum, which is particularly advantageous when working with pediatric cohorts. The project included the optimization of several critical parameters, such as antibody coupling efficiency, signal intensity, and background reduction. Immunoassays were developed and tested in both single and sandwich formats using the Luminex 200 system. In particular, antibodies capable of effectively recognizing two target proteins - ATP5PF and COQ7 - were identified using the sandwich assay format. Subsequently, absolute quantification of these proteins in serum samples was performed. Overall, this study demonstrates the feasibility of SBA-based immunoassays for quantifying disease-associated proteins in serum. The results support the validation of candidate biomarkers and lay the groundwork for the development of minimally invasive tools to support clinical research and the management of DMD.

La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una grave patologia neuromuscolare legata al cromosoma X, caratterizzata da progressiva degenerazione e debolezza muscolare. L’identificazione e la quantificazione di biomarcatori circolanti rappresentano un’opportunità promettente per migliorare il monitoraggio della malattia, la stratificazione dei pazienti e lo sviluppo di terapie mirate. Questa tesi ha come obiettivo lo sviluppo di immunoassay affidabili e riproducibili per un pannello selezionato di biomarcatori candidati rilevanti per la DMD. Il lavoro si basa sull’utilizzo della piattaforma Suspension Bead Array (SBA), una tecnologia multiplex ad alto rendimento che consente la rilevazione simultanea di più analiti in piccoli volumi di siero umano, un aspetto particolarmente vantaggioso quando si lavora con coorti pediatriche. Il progetto ha previsto l’ottimizzazione di diversi parametri critici, come l’efficienza del coupling anticorpale, l’intensità del segnale e la riduzione del background. Gli immunoassay sono stati sviluppati e testati in formato singolo e sandwich, utilizzando il sistema Luminex 200. In particolare, sono stati identificati anticorpi in grado di riconoscere efficacemente due proteine (ATP5PF e COQ7) attraverso il formato sandwich assay. Successivamente, è stata eseguita una quantificazione assoluta delle concentrazioni di queste proteine nei campioni di siero. Nel complesso, questo studio dimostra la fattibilità dell’impiego di immunoassay basati su SBA per la quantificazione di proteine associate alla malattia nel siero. I risultati ottenuti contribuiscono alla validazione di biomarcatori candidati e pongono le basi per lo sviluppo di strumenti minimamente invasivi a supporto della ricerca clinica e della gestione della DMD.