Elaborazione di un metodo biochimico per validare nuovi inibitori del complesso mitocondriale Drp1/MiD51

Mitochondrial dynamics plays a crucial role in maintaining cellular homeostasis. Mitochondria continuously undergo fission and fusion events that are essential not only for proper organelle morphology but also for the regulation of cellular metabolism. Among the key regulators of mitochondrial fission, Dynamin-Related Protein 1 (Drp1) is one of the most extensively studied factors. DRP1 activity is modulated through interactions with several mitochondrial cofactors. In our laboratory, we previously demonstrated that Mitochondrial Elongation Factor 1 (MIEF1/MID51) recruits DRP1 to the mitochondrial surface, promoting downstream signalling pathways involved in metabolic regulation. Understanding how mitochondrial dynamics impacts on cellular metabolism, represents a fascinating challenge and could help in understanding the role of mitochondria in physiological and pathological conditions. To further investigate the role of mitochondria in metabolic control, we performed a screening of small-molecule DRP1 inhibitors to evaluate their ability to disrupt the DRP1/MID51 complex. To this end, we developed and optimized a biochemical pull-down–based assay to assess compound interference with complex formation. Recombinant proteins were purified using standard biochemical approaches and their functionality was validated prior to assay implementation. Pull-down conditions were systematically optimized to establish a robust and reproducible screening platform. Overall, this work provides a methodological framework for identifying modulators of DRP1/MiD51 interaction and contributes to a deeper understanding of how mitochondrial dynamics influence metabolic regulation and nuclear transcriptional responses.

La dinamica mitocondriale gioca un ruolo fondamentale nel mantenere l'omeostasi cellulare. I mitocondri vanno costantemente incontro a eventi di fusione e fissione; tali eventi sono essenziali non solo per mantenere una morfologia appropriata, ma anche per garantire la corretta regolazione del metabolismo cellulare. Tra i fattori chiave coinvolti nella fissione mitocondriale, viene annoverato Dynamin-Related-Protein 1 (DRP1). L'attività di DRP1 è modulata attraverso l’interazione con diversi cofattori presenti sulla membrana esterna mitocondriale. Nel nostro laboratorio, abbiamo precedentemente dimostrato che il Mitochondrial Elongation Factor 1 (MIEF1/MID51) recluta DRP1 sulla superficie mitocondriale, promuovendo l’attivazione delle vie di segnalazione a valle coinvolte nella regolazione del metabolismo cellulare. Comprendere come la dinamica mitocondriale influenzi il metabolismo cellulare rappresenta una sfida rilevante, poiché consente di chiarire il ruolo dei mitocondri in condizioni fisiologiche e patologiche. Per approfondire il contributo della dinamica mitocondriale al controllo metabolico, abbiamo condotto uno screening di piccole molecole inibitorie di DRP1 al fine di valutare la capacità di tali molecole di interferire con la formazione del complesso DRP1/MID51. A tale scopo, abbiamo sviluppato e ottimizzato un saggio biochimico basato su co-precipitazione su matrice per affinità per analizzare l’effetto di composti dell'interazione proteina proteina. Le proteine ricombinanti sono state purificate utilizzando approcci biochimici standard e la loro funzionalità è stata verificata prima dell’esecuzione del saggio. Le condizioni sperimentali del saggio sono state progressivamente ottimizzate al fine di stabilire una piattaforma di screening robusta e riproducibile. Nel complesso, questo lavoro fornisce un quadro metodologico per l’identificazione di modulatori dell’interazione DRP1/MID51 e contribuisce ad approfondire la comprensione dei meccanismi attraverso cui la dinamica mitocondriale influenza la regolazione metabolica e le risposte trascrizionali nucleari.