Development of an Enzymatically PEGylated Semaglutide

This thesis project focuses on the development and the evaluation of a site-specific PEGylated derivative of semaglutide, obtained using an enzymatic conjugation approach. Semaglutide is a GLP-1 receptor agonist widely used in treatment of type 2 diabetes mellitus and, in recent years, also for the management of obesity. In this study, the peptide was selectively conjugated with mPEG20kDa-NH2 using microbial transglutaminase (mTGase) as catalysts, targeting the γ-carboxamide group of Gln23. This approach allowed for the formation of a stable isopeptide bond under mild reaction conditions, minimizing the formation of heterogeneous species. Reactions parameters were optimized in order to obtain a mono-PEGylated conjugate, which was purified by anion exchange chromatography (AEX) using a DEAE column and characterized via SDS-PAGE and RP-HPLC. The purified product was lyophilized and formulated as a spray-dried powder, using trehalose and leucine as excipients to improve stability and enable pulmonary delivery. The therapeutic efficacy of PEG20kDa-Semaglutide was evaluated in vivo in male Sprague-Dawley rats fed a high-fat diet to induce obesity. Both native and PEGylated semaglutide were administered for 14 days via subcutaneous (once every 3 days) and intratracheal routes (once daily) at a dose of 30 nmol/kg expressed as peptide equivalent. Body weight variation and food intake were monitored as primary pharmacodynamic endpoints. The results showed that both subcutaneous and intratracheal administration of native semaglutide induced a reduction in body weight compared with the control group, confirming its expected pharmacological activity. In contrast, animals treated with the PEGylated semaglutide displayed a body weight profile overlapping the one of the control groups. This finding suggests that although the enzymatic PEGylation strategy generated a site-specific semaglutide conjugate in a site that is far from the receptor recognition area, the presence of PEG has affected the biological effect of body weight reduction of the peptide in vivo. Further studies are needed to investigate if this effect is a result of impairment of receptor recognition, in general, or is instead only related to the lack of the semaglutide effects at the level of central system owing to the prevention of blood-brain barrier crossing after PEGylation.

Il presente progetto di tesi si focalizza sullo sviluppo e sulla valutazione di un derivato PEGilato sito-specifico del peptide terapeutico semaglutide, ottenuto tramite un approccio di coniugazione enzimatica. Semaglutide è un agonista del recettore GLP-1 largamente utilizzato nel trattamento del diabete mellito di tipo 2 e, negli ultimi anni, anche nel controllo dell’obesità. In questo studio, il peptide è stato coniugato selettivamente con mPEG20kDa-NH2 utilizzando come catalizzatore l’enzima transglutaminasi microbica (mTGase) e prendendo come bersaglio il gruppo γ-carbossammidico della Gln23. Questa reazione ha portato alla formazione di un legame isopeptidico stabile in condizioni di reazione blande, minimizzando così la formazione di specie eterogenee. I parametri di reazione sono stati ottimizzati al fine di ottenere un monoconiugato PEGilato che successivamente è stato purificato mediante cromatografia a scambio anionico (AEX) utilizzando una colonna DEAE e caratterizzato tramite SDS-PAGE e RP-HPLC. Il prodotto purificato è stato liofilizzato e formulato come polvere tramite spray-drying, utilizzando trealosio e leucina come eccipienti. L’efficacia terapeutica è stata valutata in vivo in ratti maschi Sprague-Dawley alimentati con una dieta ad alto contenuto lipidico per indurre obesità. Sia semaglutide nativa che PEGilata sono state somministrate per 14 giorni tramite via sottocutanea (una volta ogni 3 giorni) e via intratracheale (una volta al giorno) a una dose di 30 nmol/kg (in equivalenti di semaglutide) ed è stata misurata la variazione di peso corporeo come principale endpoint farmacodinamico. I risultati hanno dimostrato che sia la somministrazione sottocutanea che quella intratracheale di semaglutide nativa hanno determinato una riduzione del peso corporeo rispetto ai rispettivi gruppi di controllo, confermando l’attività farmacologica del peptide e il vantaggio della somministrazione intratracheale. Al contrario, però, gli animali trattati con semaglutide PEGilata con entrambe le vie di somministrazione hanno mostrato un andamento del peso sovrapponibile a quello dei rispettivi controlli. Questo risultato suggerisce che, sebbene la strategia di PEGilazione enzimatica abbia generato un coniugato di semaglutide sito-specifico in una posizione distante dall’area di riconoscimento del recettore, la presenza del PEG ha influenzato l’effetto biologico di riduzione del peso corporeo del peptide in vivo. Ulteriori studi sono necessari per chiarire se questo effetto sia dovuto a una compromissione generale del riconoscimento del recettore oppure se sia invece legato specificamente alla perdita degli effetti centrali del semaglutide, a causa dell’impossibilità del coniugato PEGilato di attraversare la barriera emato-encefalica.