Produzione e Caratterizzazione Chimica e Strutturale della Variante Naturale Pro-Trombotica Padova 3 (Glu77Lys) della α-Trombina Umana

Thrombin (αT) is a serine protease that plays a dual role in regulating coagulation homeostasis: on the one hand, it catalyzes all the reactions necessary for proper coagulation, on the other, it ensures the maintenance of blood fluidity in regions unaffected by the lesion. Prethrombin-2 (Pre2) is the immediate zymogen of αT and represents a widely used model for studying the relationships between the structure, conformation dynamics, and catalytic function of αT. Recently, a new thrombin variant called Padova 3 (Glu77Lys; ProT-PD3) was identified in a patient admitted to the University Hospital of Padua following recurrent thrombotic events. The Glu77Lys mutation involves loop 70, a region that, together with loop 30, contributes to the formation of exosite I of αT. This region is responsible for recognizing both procoagulant substrates (fibrinogen and PAR1) and anticoagulant ones (thrombomodulin). This thesis investigated the structural and conformational basis of the altered procoagulant function of the PD3 variant by studying Pre2-PD3 and αT-PD3, and comparing them with the respective Pre2-WT and αT-WT forms. The Glu77Lys variant was produced by site-directed mutagenesis on the plasmid encoding the wild-type Pre2 protein and expressed in E. coli cells. It was subsequently purified by biospecific affinity chromatography, and its molecular identity was determined by SDS-PAGE, RP-HPLC, and high-resolution mass spectrometry. The αT form was obtained by proteolytic activation with Echis carinatus II protease. Circular dichroism and fluorescence spectroscopy analyses have shown that the Glu77Lys substitution causes a perturbation in the conformational structure of the Pre2 species. Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) analyses of the inactive forms confirm and complement the findings from biospectroscopic analyses, indicating a marked increase in deuterium incorporation for the mutated protein. The same behavior was observed in global HDX-MS analyses of the αT-WT and αT-PD3 forms. Local HDX-MS analyses of the inactive forms also confirm the perturbation and increased flexibility observed in all previous analyses. Local HDX-MS analyses of the αT-WT and αT-PD3 forms identify three peptides as primarily responsible for the increased degree of disorder in αT-PD3 detected by global HDX-MS analyses. These peptides include loop 70, loop 30, and the catalytic histidine (H57). Overall, the results demonstrate that the Glu77Lys substitution induces significant alterations in the protein's structural and dynamic properties, shifting the conformational equilibrium toward more flexible states compared to the wild-type form and disrupting both the structure of exosite I and the protein's flexibility around the catalytic histidine. These modifications could contribute to the molecular mechanisms underlying the unique thrombotic phenotype associated with the Padova 3 variant.

La trombina (αT) è una serin proteasi che svolge un duplice ruolo nella regolazione dell’omeostasi coagulativa: da un lato catalizza tutte le reazioni necessarie alla corretta coagulazione, dall’altro, assicura il mantenimento della fluidità del sangue nei distretti non interessati dall’insulto lesivo. La pretrombina-2 (Pre2) è lo zimogeno più immediato della αT e rappresenta un modello ampiamente utilizzato per lo studio delle relazioni tra struttura, dinamica conformazionale e funzione catalitica dell’αT. Recentemente, in un paziente ricoverato presso l’Azienda Ospedale Università di Padova a seguito di ricorrenti eventi trombotici, è stata identificata una nuova variante della trombina denominata Padova 3 (Glu77Lys; ProT-PD3). La mutazione Glu77Lys coinvolge il loop 70, una regione che, insieme al loop 30, contribuisce alla formazione dell'esosito I dell’αT. Questa è una regione deputata sia al riconoscimento di substrati ad attività procoagulante (fibrinogeno e PAR1), che ad attività anticoagulante (trombomodulina). Nel presente lavoro di Tesi sono state indagate le basi strutturali e conformazionali dell’alterata funzione procoagulante della variante PD3 attraverso lo studio della Pre2-PD3 e αT-PD3, e il confronto con le rispettive forme Pre2-WT e αT-WT. La variante Glu77Lys è stata prodotta mediante mutagenesi sito-specifica sul plasmide codificante per la proteina Pre2 wild-type ed espressa in cellule di E. coli. Successivamente, è stata purificata tramite cromatografia di affinità biospecifica, e la sua identità molecolare è stata determinata mediante SDS-PAGE, RP-HPLC e spettrometria di massa ad alta risoluzione. La forma αT è stata ottenuta mediante attivazione proteolitica con Echis carinatus II protease. Le analisi di dicroismo circolare e di spettroscopia di fluorescenza hanno evidenziato che la sostituzione Glu77Lys determina una perturbazione dell’assetto conformazionale della specie Pre2. Le analisi eseguite mediante Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) sulle forme inattive confermano e integrano le evidenze raccolte dalle analisi biospettroscopiche, indicando un marcato aumento dell’incorporazione di deuterio per la proteina mutata. Lo stesso comportamento è stato osservato nell’analisi global HDX-MS delle forme αT-WT e αT-PD3. Anche le analisi local HDX-MS delle forme inattive confermano la perturbazione e l’incremento di flessibilità osservati in tutte le analisi precedenti. Le analisi local HDX-MS delle forme αT-WT e αT-PD3 individuano tre peptidi come principali responsabili dell’aumento del grado di disordine di αT-PD3 rilevato dalle analisi global HDX-MS. In questi peptidi sono compresi il loop 70, il loop 30 e l’istidina catalitica (H57). Complessivamente, i risultati ottenuti dimostrano che la sostituzione Glu77Lys induce significative alterazioni delle proprietà strutturali e dinamiche della proteina, spostando l’equilibrio conformazionale verso stati maggiormente flessibili rispetto alla forma wild-type, e perturbando sia la struttura dell’esosito I che la flessibilità della proteina nell’intorno dell’istidina catalitica. Tali modificazioni potrebbero contribuire ai meccanismi molecolari alla base del peculiare fenotipo trombotico associato alla variante Padova 3.