Differenze di sesso nell’espressione e rilascio di PD-L1 in cellule endoteliali umane

I checkpoint immunitari sono una classe di molecole che regola negativamente l’infiammazione, trasducendo segnali inibitori per le cellule del sistema immunitario. PD-L1 è il primo ligando caratterizzato del recettore PD-1, uno dei recettori più studiati e di maggiore interesse in ambito clinico. L’interazione tra PD-1 e PD-L1 svolge un ruolo importante nel contesto dell’infiammazione (infezioni e malattie autoimmuni) e del cancro. In oncologia, il blocco farmacologico di questo recettore o dei suoi ligandi può essere sfruttato per riattivare il sistema immunitario. Pazienti trattati con inibitori di checkpoint immunitari hanno tuttavia riportato effetti avversi riconducibili ad una alterata regolazione del sistema immunitario. PD-L1 è costitutivamente espresso in diversi tipi cellulari, tra cui le cellule del sistema immunitario e le cellule endoteliali, e può essere espresso in risposta a stimoli infiammatori come segnale immunosoppressivo. Anche il VEGF, stimolo immunomodulatore, è in grado di aumentare l’espressione di PD-1/PD-L1 nei leucociti e farmaci diretti contro il VEGF o il segnale da esso mediato modulano questa espressione. Il nostro obiettivo è stato quello di valutare le possibili differenze di sesso nell’espressione e nel trafficking della proteina PD-L1 in cellule endoteliali umane. Abbiamo valutato l’espressione di PD-L1 in colture primarie di cellule endoteliali derivate da funicoli ombelicali (HUVEC) di donatori maschi e femmine in risposta a diversi stimoli infiammatori e a VEGF. I livelli di proteina totale espressa nei campioni ottenuti sono stati valutati tramite western blot; l’espressione di PD-L1 di membrana (mPD-L1) è stata rilevata tramite citofluorimetria; il rilascio nel surnatante di PD-L1 solubile (sPD-L1) è stato valutato mediante saggio ELISA. L’espressione di PD-L1 in cellule endoteliali non differenziate in base al sesso è incrementata a seguito di stimolazione per 24h con agenti pro-infiammatori quali IL-1β, IL-6 o LPS, con una grande variabilità tra campioni. In cellule differenziate in base al sesso, l’espressione di PD-L1 è aumentata nelle HUVEC derivate da donatrici (fHUVEC) stimolate con LPS, IL-1β, IL-6 o VEGF per 24h; nelle stesse condizioni, i livelli di PD-L1 nelle mHUVEC non hanno subito variazioni significative rispetto al controllo. Al contrario, in condizioni basali, i livelli di PD-L1 nelle mHUVEC sono risultati maggiori rispetto a quelli osservati nelle fHUVEC. Stimolando per 24h le HUVEC con IL-1β o IFN-γ, usata come controllo positivo, non abbiamo riscontrato variazioni nell’espressione di PD-L1 di membrana. Questo ci ha portato a prendere in considerazione i livelli di sPD-L1 rilasciato dalle HUVEC. Le fHUVEC stimolate da 3 a 24h con IL-1β o VEGF hanno rilasciato sPD-L1 nel mezzo di coltura con un andamento tempo dipendente; nelle stesse condizioni, i livelli di sPD-L1 rilasciato dalle mHUVEC non sono aumentati rispetto al basale. Inoltre, dati preliminari mostrano come il pretrattamento con il sunitinib (0.1 – 1 µM) prevenga l’aumento dell’espressione di PD-L1 indotto dal VEGF e il suo rilascio nelle fHUVEC. In conclusione, l’espressione e il trafficking di PD-L1 endoteliale sono regolati da diversi agenti infiammatori e dal VEGF, in maniera tempo dipendente e genere specifica, suggerendo che questo possa rappresentare un meccanismo di regolazione negativo dell’autoimmunità, condizione alla quale le donne sono maggiormente predisposte. Il rilascio di sPD-L1 dall’endotelio potrebbe contribuire al controllo dello stato infiammatorio tramite meccanismi di regolazione a distanza del sistema immunitario e potrebbe rappresentare un biomarcatore di risposta a terapie con inibitori del checkpoint immunitario.