Caratterizzazione in pomodoro del gene candidato MYB80 per l'induzione di sterilità maschile

Genome editing includes a range of techniques that allows specific modifications to the DNA at precise points within the genome. This set of technologies employs site-specific nucleases to introduce specific DNA breaks, with subsequent cellular repair mechanisms like NHEJ or HDR used to mend the damage. This technology offers significant potential for targeted genome modification and has important implications in both research and practical applications, such as plant genetic engineering. Among various editing systems, the CRISPR-Cas system is one of the most significant tools for precise genome manipulation due to its simplicity, versatility, efficiency, and specificity. Consequently, this strategy has been widely employed for DNA manipulation in genetic improvement across a broad range of organisms, representing a significant advancement over previous DNA editing techniques. In the context of genetic improvement, facilitated by genetic engineering technologies, it is essential to avoid the presence of foreign DNA sequences in modified plants. For this reason, numerous techniques have been developed that are capable of modifying an organism's genome without leaving behind foreign DNA sequences. One of these techniques is undoubtedly transient transfection mediated by RNP complexes within plant protoplasts. In this thesis work, the focus is on the potential application of this technique for inducing male sterility in Microtom tomato plants, with the goal of targeted cross-breeding between two selected parental plants to express the phenomenon of heterosis in F1 hybrids, a topic of great interest in the field of agriculture. Specifically, in this research, the emphasis is on characterizing the candidate gene SolycMYB80 and implementing a protoplast isolation system from Microtom tomato plants with the intention of conducting transient transfection experiments using RNP complexes targeted at SolycMYB80.

L’editing genomico comprende una serie di tecniche che permettono di apportare modifiche specifiche al DNA in punti precisi del genoma. Questo insieme di tecnologie sfrutta nucleasi sito – specifiche per introdurre rotture specifiche nel DNA, e i successivi meccanismi cellulari di riparazione NHEJ o HDR per riparare il danno. Questa tecnologia offre possibilità significative per la modifica mirata del genoma e ha importanti implicazioni nella ricerca e nell'applicazione pratica, come l'ingegneria genetica delle piante. Tra i diversi sistemi di editing, il sistema CRISPR-Cas è uno dei più importanti strumenti per la manipolazione mirata del genoma grazie alla sua semplicità, versatilità, efficienza e specificità. Per questo motivo tale strategia è stata ampiamente utilizzata per la manipolazione del DNA per il miglioramento genetico in una vasta gamma di organismi, in quanto rappresenta un notevole avanzamento rispetto alle tecniche di editing del DNA precedenti. Nell’ambito del miglioramento genetico, mediato da tecnologie di ingegneria genetica, è fondamentale evitare la presenza di sequenze di DNA estraneo nelle piante modificate. Per questo motivo sono state messe a punto numerose tecniche in grado di modificare il genoma di un organismo senza che in esso permangano sequenze di DNA estraneo. Una di queste è sicuramente la trasfezione transiente mediata da complesso RNP all’interno di protoplasti di piante. In questo lavoro di tesi ci si è focalizzati sulla possibilità di applicare questa tecnica nell’induzione di sterilità maschile in piante di pomodoro cv. Microtom, in modo da controllare in modo mirato gli incroci tra due parentali selezionati per esplicare il fenomeno di eterosi negli ibridi F1, argomento di grande interesse nel settore dell’agricoltura. In particolare, in questa ricerca ci si è concentrati sulla caratterizzazione del gene candidato SolycMYB80 e sull’implementazione di un sistema di isolamento di protoplasti da piante di pomodoro cv. Microtom con l’intenzione di condurre esperimenti di trasfezione transiente con complessi RNP mirati a SolycMYB80.