Degradable hydrogels with simultaneous presence of boron compounds and cell adhesion domains for the muscular reconstruction

Muscular injuries, whether from trauma, ageing, or pathological conditions like dystro- phies, often require invasive interventions or transplants and sometimes lack e↵ective solutions, as seen in Duchenne or Becker dystrophies. Tissue engineering o↵ers a promising, biocompatible alternative. This master thesis ex- plores the development of PEG (polyethylene glycol) hydrogels composed of PEG-4MAL and two crosslinkers, VPM and PEG-diSH, used in 50:50 ratio. Therefore, the hydro- gels containing the VPM peptide, degradable by metalloprotease MMPs, combined with PEG-diSH, result in a controlled degradation rate of the hydrogels of the 50%. These 3D structures were further enriched with RGD (a cell adhesion motif) and boron compounds such as Bortezomib, aiming to activate NaBC1 boron transporter and the binding-integrins present on the surface of cells. This activation fosters cellular adhesion, proliferation, and di↵erentiation. This master thesis project mainly focused on the analysis of the material’s physico- chemical properties and its biocompatibility. The study involved several experimental setups: pure PEG, PEG-RGD, PEG-RGD-Boron and PEG-RGD-Bortezomib. Swelling assays were performed to measure water absorption capacity and physical sta- bilization over time. Degradation assays were carried out to evaluate the enzymatic degradation of the hydrogels (due to the VPM). Rheological tests using a hybrid rheometer assessed the visco-elastic properties through strain and frequency sweeps. Biocompatibility was then verified in vitro using an MTS assay with two human fibroblast lines, measuring cell viability and toxicity of the material itself. Additionally, in vivo tests were conducted using fertilized eggs, evaluating vascularization by analyzing angiogenesis. This work takes part of a bigger research project which has the main aim to study mus- cular regeneration. Further experiments could involve the verification of the actual cell adhesion, proliferation and di↵erentiation. This tissue engineering field holds significant promise for muscular regeneration, poten- tially o↵ering solutions for currently untreatable conditions.

Le lesioni muscolari, siano esse dovute a traumi, invecchiamento o condizioni patologiche come le distrofie, spesso richiedono interventi invasivi o trapianti e talvolta mancano di soluzioni ecaci, come si osserva nelle distrofie di Duchenne o Becker. L’ingegneria tissutale o↵re un’alternativa promettente e biocompatibile. Questa tesi di laurea magis- trale esplora lo sviluppo di hydrogel di PEG (polietilenglicole) composti da PEG-4MAL e due crosslinker, VPM e PEG-diSH, utilizzati in rapporto 50:50. Gli hydrogel contenenti il peptide VPM, degradabile dalle metalloproteasi (MMPs), combinato con PEG-diSH, risultano in un tasso di degradazione controllato degli hydrogel del 50%. Queste strutture 3D sono state ulteriormente arricchite con RGD (una sequenza di ade- sione cellulare) e composti di boro come il Bortezomib, con l’obiettivo di attivare i trasportatori di boro NaBC1 e le integrine presenti sulla superficie delle cellule. Questa attivazione favorisce l’adesione cellulare, la proliferazione e la di↵erenziazione. Questo progetto di tesi di laurea si `e principalmente concentrato sull’analisi delle propriet`a fisico-chimiche e della biocompatibilit`a del materiale. Lo studio ha coinvolto diversi setup sperimentali: PEG puro, PEG-RGD, PEG-RGD-Boro e PEG-RGD-Bortezomib. Sono stati eseguiti saggi di swelling per misurare la capacit`a di assorbimento d’acqua e la stabilizzazione fisica nel tempo. I saggi di degradazione sono stati invece in seguito e↵ettuati per valutare la degradazione enzimatica degli hydrogel (dovuta al VPM). Test reologici utilizzando un reometro ibrido hanno valutato le proprieta` visco-elastiche attraverso sweep di deformazione e frequenza. La biocompatibilita` `e stata poi verificata in vitro utilizzando un saggio MTS con due linee di fibroblasti umani, misurando la vitalit`a cellulare e la tossicita` del materiale stesso. Infine, sono stati condotti test in vivo utilizzando uova fecondate, valutando la vascolar- izzazione attraverso l’analisi dell’angiogenesi. Questo lavoro fa parte di un piu` ampio progetto di ricerca che ha come obiettivo princi- pale lo studio della rigenerazione muscolare. Ulteriori esperimenti potrebbero coinvolgere la verifica dell’e↵ettiva adesione, proliferazione e di↵erenziazione cellulare. Questo campo dell’ingegneria tissutale ha un grande potenziale per la rigenerazione mus- colare, o↵rendo soluzioni per condizioni attualmente incurabili.