Caratterizzazione della struttura secondaria dell'mRNA della proteina timidilato sintasi tramite misure di spettroscopia di forza a livello di singola molecola

Thymidylate synthase (TS) is a key protein involved in the folate cycle, essential for DNA replication and repair in cells. Inhibiting its catalytic function leads to cell death, making TS a known and validated target for cancer therapy. Additionally, TS has another crucial function in cells called "autoregulatory": the protein can bind to its own messenger RNA (TSmRNA) to regulate the biosynthesis of new protein, thus controlling its concentration within the cell. Unfortunately, the most commonly used drug against TS in the treatment of solid tumors can inhibit the catalytic function of TS, but negatively interferes with its autoregulatory function, leading to the development of chemoresistance. To address these issues, new drugs have been developed, but their validation requires a thorough study of the structure of TSmRNA and its interaction with the TS protein. The aim of this thesis work is to characterize the secondary structure of TSmRNA through single-molecule force spectroscopy measurements. In this thesis work, optical tweezers has been used to manipulate and characterize single molecules of TSmRNA, mainly through passive hopping measurements at constant force, using the Bell-Evans model to determine the main energetic parameters of the molecule.

La timidilato sintasi (TS) è una proteina chiave coinvolta nel ciclo dei folati, e pertanto essenziale per la replicazione e riparazione del DNA nelle cellule. L’inibizione di questa sua funzione catalitica porta infatti alla morte cellulare, e per tale motivo TS rappresenta un target noto e validato per la terapia contro il cancro. TS possiede inoltre un'altra funzione essenziale per la cellula, detta di "autoregolazione": la proteina è infatti in grado di legarsi al suo RNA messaggero (TSmRNA) per regolare la biosintesi di nuova proteina, controllando in tal modo la sua stessa concentrazione all'interno della cellula. Purtroppo, il farmaco maggiormente usato contro TS nel trattamento di tumori solidi riesce ad inibire la funzione catalitica di TS, ma interferisce negativamente su quella autoregolatoria, provocando l'insorgere di fenomeni di chemioresistenza. Per ovviare a tali problemi, sono stati sviluppati nuovi farmaci, la cui validazione richiede però un preventivo e più approfondito studio della struttura di TSmRNA e della sua interazione con la proteina TS. Lo scopo di questo lavoro di tesi è caratterizzare la struttura secondaria di TSmRNA tramite misure di spettroscopia di forza a livello di singola molecola. In questo lavoro di tesi sono state usate le pinzette ottiche per manipolare e caratterizzare singole molecole di TSmRNA, principalmente tramite misure passive di hopping a forza costante, utilizzando il modello di Bell Evans per determinare i principali parametri energetici della molecola.