Supramolecular oligocationic bioconjugates for systemic nucleic acid delivery

Gene therapy represents one of the most promising techniques currently available for the treatment and management of a range of diseases, including cancer. The ongoing development of this field has led to nucleic acids assuming an increasingly important role in the drugs used today. Nevertheless, the delivery of these molecules into cells represents a considerable challenge due to their intrinsic properties. Indeed, the main obstacles to the delivery of nucleic acids are their biological instability in bloodstream, non-specific distribution and poor cellular uptake. Nucleic acids possess a high molecular weight and are negatively charged, rendering them unable to be taken up by biological membranes, which are typically negatively charged. Despite the proven efficacy of viral vectors as a delivery system, their use is controversial due to safety concerns. In contrast, considerable effort was invested in the development of cationic carriers capable of condensing nucleic acids to form polyplexes. Based on these needs, this thesis project aimed to synthetize a supramolecular non-viral polycationic vector based on an oligosaccharide scaffold capable of electrostatic interaction with nucleic acids and characterisation of its biopharmaceutical properties. Maltotriose was chosen as the core of polymeric carrier synthesis due to its favorable biopharmaceutical properties such as biodegradability, high biocompatibility, and low immunogenicity. Furthermore, the large number of hydroxyl groups is ideal for achieving a high degree of functionalization with cationic charge through conjugation with suitable functional groups. Specifically, the polymeric carrier was designed by first performing a conjugation of an amino terminal aliphatic carboxylic acid on the anomeric carbon of maltotriose. This was done with the objective of facilitating subsequent derivatization with BOC-PEG2kDa-NH2 chain, with the aim of enhancing the biological compatibility of the carrier and providing the nanocarrier with masking properties. After PEGylation, the hydroxyl groups of the maltotriose were functionalized with the acrylic anhydride, obtaining the platform to conjugate cationic groups via the via the thiol-Michael addition reaction, thereby creating a positive charge on the maltotriose core. The second part of the project is dedicated to the characterization of previously synthesized polyplexes comprising guanidine groups (G-OCP) and tertiary amine groups (D-OCP) as the cationic component. The formation of polyplexes at varying nitrogen/phosphate (N/P) ratios was investigated through agarose gel electrophoresis assays at N/P ratios between 1:1 and 1:10. The N/P ratio of 5 was identified as the optimal ratio for achieving complete complexation of siRNA. The strength and stability of polyplexes was confirmed by the heparin displacement test performed by electrophoresis gel shift assay, which showed that the total displacement of siRNA from the polyplexes was achieved at a heparin concentration of 7.5 IU/mL, which is much higher than the concentration present in blood. In order to obtain a quantitative parameter on the complexation efficiency of nucleic acids to cationic polymers, studies have been carried out on the association with various N/P ratios between 1:1 and 10:1 by the Ribogreen test, which allows to evaluate the concentration of RNA condensed to the cationic polymer.

La terapia genica rappresenta una delle tecniche più promettenti attualmente disponibili per il trattamento e la gestione di una serie di malattie, tra cui il cancro. Il continuo sviluppo di questo campo ha portato gli acidi nucleici ad assumere un ruolo sempre più importante nei farmaci utilizzati oggi. Tuttavia, il trasporto di queste molecole nelle cellule rappresenta una sfida considerevole a causa delle loro proprietà intrinseche. Infatti, i principali ostacoli alla somministrazione degli acidi nucleici sono la loro instabilità biologica nel flusso sanguigno, la distribuzione non specifica e lo scarso assorbimento cellulare. Gli acidi nucleici hanno un peso molecolare elevato e sono carichi negativamente, ciò li rende incapaci di essere assorbiti dalle membrane biologiche, che sono tipicamente cariche negativamente. Nonostante la comprovata efficacia dei vettori virali come sistema di somministrazione, il loro uso è controverso a causa di problemi di sicurezza. Inoltre, sono stati investiti notevoli sforzi nello sviluppo di vettori cationici in grado di condensare gli acidi nucleici per formare poliplessi. Sulla base di queste esigenze, il presente progetto di è stato improntato allo sviluppo di un sistema policationico non virale di natura oligosaccaridica in grado di interagire elettrostaticamente con gli acidi nucleici e alla sua caratterizzazione biofarmaceutica. Il maltotriosio è stato scelto come nucleo centrale per la sintesi del vettore polimerico grazie alle sue favorevoli proprietà biofarmaceutiche, come la biodegradabilità, l'elevata biocompatibilità e la bassa immunogenicità. Inoltre, l'elevato numero di gruppi idrossilici è ideale per ottenere un alto grado di funzionalizzazione con gruppi funzionali adeguati. In particolare, il vettore polimerico è stato progettato eseguendo prima una coniugazione con un acido carbossilico alifatico terminale amminico sul carbonio anomerico del maltotriosio. Ciò è stato fatto con l'obiettivo di facilitare la successiva derivatizzazione con la catena BOC-PEG2kDa-NH2, allo scopo di migliorare la compatibilità biologica del vettore e di fornire al nanocarrier proprietà di mascheramento. Dopo la PEGilazione, i gruppi idrossilici del maltotriosio sono stati esterificati con l'anidride acrilica, ottenendo la piattaforma per coniugare gruppi cationici attraverso la reazione di addizione di Michael, creando così cariche positive sul nucleo del maltotriosio. La seconda parte del progetto è dedicata alla caratterizzazione di poliplessi precedentemente sintetizzati aventi gruppi guanidinici (G-OCP) e gruppi amminici terziari (D-OCP) come componente cationica. La formazione di poliplessi a diversi rapporti azoto/fosfato (N/P) è stata studiata attraverso saggi di elettroforesi su gel di agarosio con rapporti N/P compresi tra 1:1 e 1:10. Il rapporto N/P di 5.1 è stato identificato come il rapporto ottimale per ottenere la completa complessazione del siRNA. La stabilità dei poliplessi è stata confermata dal test di spostamento dell'eparina eseguito mediante gel elettroforesi, che ha mostrato che lo spostamento totale del siRNA dai poliplessi è stato raggiunto a una concentrazione di eparina di 7,5 UI/mL, che è molto più alta della concentrazione presente nel sangue. Per ottenere un parametro quantitativo sull'efficienza di complessazione degli acidi nucleici ai polimeri cationici, sono stati condotti studi di associazione con vari rapporti N/P tra 1:1 e 10:1 mediante il test Ribogreen, che consente di valutare la concentrazione di RNA complessata al polimero cationico.