Sviluppo di un metodo di micropurificazione del fattore di von Willebrand da plasma umano per la quantificazione mediante spettrometria di massa di modifiche ossidative pro-trombotiche

Il diabete di tipo 2 (Type 2 Diabetes, T2D) è una condizione cronica caratterizzata da insulino-resistenza e iperglicemia che aumenta significativamente il rischio di complicanze cardiovascolari, inclusa la trombosi. Rispetto ad un soggetto sano, i pazienti affetti da T2D presentano elevati livelli di infiammazione e stress ossidativo, alterazioni emoreologiche, disregolazione del sistema coagulativo e disfunzione del fattore di von Willebrand (von Willebrand Factor, vWF). Lo scopo di questo lavoro di Tesi è di mettere a punto un metodo analitico basato sulla spettrometria di massa che permetta di dimostrare se esiste una correlazione tra lo stato di ossidazione del vWF ed il livello di rischio trombotico in pazienti con T2D. Il vWF è una glicoproteina omomultimerica, composta da monomeri dal peso di 250 kDa, che viene rilasciata nel torrente circolatorio sotto forma di oligomeri ad alto peso molecolare (Ultra Large-vWF). Questi oligomeri, interagendo con piastrine e collagene, partecipano alla formazione del tappo emostatico primario e svolgono quindi una funzione coagulante. Il potenziale pro-emostatico del vWF aumenta in maniera proporzionale al suo peso molecolare e al suo stato di oligomerizzazione. Le dimensioni degli oligomeri di vWF sono regolate da ADAMTS13, una zinco-proteasi altamente specifica in grado di idrolizzare la proteina a livello del legame peptidico Tyr1605-Met1606. Da precedenti studi è stato dimostrato che in pazienti con patologie caratterizzate da elevato stress ossidativo legato ad infiammazione sistemica, si verifica l’ossidazione del residuo di metionina 1606 di vWF. Questa modifica chimica impedisce ad ADAMTS13 di riconoscere il substrato e di proteolizzare il vWF causando un aumento e un accumulo a livello circolatorio di Ultra Large-vWF. Come conseguenza si ha lo spostamento dell’equilibrio del processo coagulativo verso un rischio pro-trombotico. Al fine di poter determinare il livello di ossidazione del residuo Met1606 di vWF nel plasma, nel presente progetto di Tesi è stato inizialmente ottimizzato un protocollo di micropurificazione del vWF a partire da volumi ridotti di plasma, compatibili con il prelievo ospedaliero (~5mL). Questa fase rappresenta una sfida notevole in quanto il plasma è una matrice complessa, in cui la concentrazione del vWF è soltanto 10 μg/mL e dove poche proteine rappresentano oltre il 90% dell’abbondanza proteica totale. Il protocollo testato prevede la rimozione della albumina umana che presenta una concentrazione di 35-50 mg/ml nel plasma, seguita da passaggi di ultrafiltrazione il cui scopo è di eliminare proteine con peso molecolare sotto un cut off di 100 kDa, arricchendo il campione in vWF. Alla purificazione del campione è seguita la messa a punto della digestione di vWF, tale da ottenere un peptide proteotipico contenente il residuo Met1606 che ne permetta la quantificazione del livello di ossidazione mediante spettrometria di massa. Tramite la messa a punto di un metodo di spettrometria di massa per l'analisi del peptide proteotipico e di un protocollo di arricchimento del campione è stato possibile identificare alcuni peptidi del vWF nel plasma. I risultati ottenuti indicano che per studiare in dettaglio lo stato di ossidazione della proteina è necessario un aumento del grado di purificazione della proteina presente nel campione attraverso l’introduzione di ulteriori passaggi di frazionamento. La metodica analitica sviluppata in questa Tesi costituisce comunque un buon punto di partenza per lo sviluppo di un nuovo test diagnostico che, applicato ad un elevato numero di campioni, permetterà di verificare se esista una correlazione statisticamente significativa tra il livello di ossidazione del residuo Met1606 e il livello di rischio trombotico in pazienti con T2D.