Il carcinoma epatocellulare (HCC) è una delle principali cause di mortalità per cancro a livello globale. Un fattore che promuove l’aggressività tumorale è il fenomeno della transizione epitelio-mesenchimale (EMT), nella quale le cellule epiteliali perdono progressivamente la loro polarità acquisendo un fenotipo mesenchimale, che conferisce loro proprietà invasive e migratorie. Questo processo può essere innescato dal rilascio nel microambiente tumorale di diverse citochine proinfiammatorie, tra cui il tumor necrosis factor α (TNFα). Le principali vie di segnalazione che promuovono l’induzione di EMT sono PI3K/AKT/mTOR e NF-kB, mentre i principali marcatori di EMT sono la downregolazione della E-caderina e il contemporaneo aumento dell’espressione di vimentina, β-catenina ed N-caderina. Esiste inoltre una relazione tra l'aumento dell’espressione del checkpoint immunitario PD-L1, facilitando l’evasione immunitaria delle cellule tumorali, e l'induzione di EMT. In questo progetto di tesi sono state testate due formulazioni liposomiali contenenti Doxorubicina, denominate SIL (Stealth ImmunoLiposomes) ed SL (Stealth Liposomes), di cui la prima è funzionalizzata con il Fab dell’anticorpo monoclonale Atezolizumab, diretto contro PD-L1, mentre la seconda non è direzionata. Il primo obiettivo di questa tesi è stato quello di valutare l’effetto di queste formulazioni sull’espressione dei principali marcatori di EMT e delle proteine implicate nei pathway di induzione di tale processo, attraverso qRT-PCR e saggio di immunocitochimica su colture bidimensionali delle linee cellulari umane di epatocarcinoma HepG2 e Huh7, stimolate con TNFα. L’analisi genica dei marcatori di EMT non ha evidenziato alcuna modulazione significativa da parte dei trattamenti. La formulazione SIL ha però dimostrato un’efficacia nella riduzione dell’espressione di PD-L1 in entrambe le linee cellulari, mentre la formulazione SL non ha causato modifiche della sua espressione. Per quanto riguarda i pathway di induzione dell’EMT, è stato osservato come SIL riduca l’mRNA della subunità di NF-kB che regola la trascrizione dei geni bersaglio (p65) nelle cellule HepG2 e l’espressione sia genica che proteica di AKT1 in entrambe le linee cellulari. Il secondo obiettivo di questo progetto di tesi è stato quello di sviluppare un modello cellulare tridimensionale più complesso, costituito da sferoidi tumorali multicellulari, ottenuti con una linea cellulare epatocitaria umana (HepG2 o Huh7) e una di cellule fibrogeniche (modello di cellule epatiche stellate, LX2). I modelli multicellulari di HepG2/LX2 e Huh7/LX2 sono stati utilizzati per verificare l’effetto delle formulazioni in esame sulla regressione dell’EMT e sull’espressione di PD-L1. Entrambe le formulazioni hanno dimostrato una tendenza a contrastare l’EMT, portando ad una diminuzione dell’espressione di proteine associate al fenotipo mesenchimale come la vimentina, e contemporaneamente all’aumento dell’espressione di E-caderina. Gli esperimenti condotti sui modelli tridimensionali hanno anche dimostrato l’efficacia del trattamento con SIL sulla riduzione dell’espressione sia di PD-L1 che di AKT1. In conclusione, i risultati ottenuti nei modelli sia bidimensionali che tridimensionali suggeriscono che la formulazione direzionata SIL sia in grado di contrastare il processo di EMT e di ridurre l’espressione del checkpoint immunitario PD-L1. Al contrario, la formulazione SL è meno efficace nel modulare questi eventi. Tuttavia, è importante sottolineare come i risultati ottenuti nei modelli tridimensionali siano ancora preliminari e richiedano ulteriori approfondimenti. L'ottimizzazione dei modelli 3D e la validazione dei risultati saranno essenziali per confermare l'efficacia di queste formulazioni e per esplorare in modo approfondito i loro meccanismi e, auspicabilmente, nuove applicazioni terapeutiche.

Effetti di formulazioni liposomiali direzionate verso il checkpoint immunitario PD-L1 in modelli cellulari bi- e tridimensionali di epatocarcinoma

CALONEGO, MARTINA
2023/2024

Abstract

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è una delle principali cause di mortalità per cancro a livello globale. Un fattore che promuove l’aggressività tumorale è il fenomeno della transizione epitelio-mesenchimale (EMT), nella quale le cellule epiteliali perdono progressivamente la loro polarità acquisendo un fenotipo mesenchimale, che conferisce loro proprietà invasive e migratorie. Questo processo può essere innescato dal rilascio nel microambiente tumorale di diverse citochine proinfiammatorie, tra cui il tumor necrosis factor α (TNFα). Le principali vie di segnalazione che promuovono l’induzione di EMT sono PI3K/AKT/mTOR e NF-kB, mentre i principali marcatori di EMT sono la downregolazione della E-caderina e il contemporaneo aumento dell’espressione di vimentina, β-catenina ed N-caderina. Esiste inoltre una relazione tra l'aumento dell’espressione del checkpoint immunitario PD-L1, facilitando l’evasione immunitaria delle cellule tumorali, e l'induzione di EMT. In questo progetto di tesi sono state testate due formulazioni liposomiali contenenti Doxorubicina, denominate SIL (Stealth ImmunoLiposomes) ed SL (Stealth Liposomes), di cui la prima è funzionalizzata con il Fab dell’anticorpo monoclonale Atezolizumab, diretto contro PD-L1, mentre la seconda non è direzionata. Il primo obiettivo di questa tesi è stato quello di valutare l’effetto di queste formulazioni sull’espressione dei principali marcatori di EMT e delle proteine implicate nei pathway di induzione di tale processo, attraverso qRT-PCR e saggio di immunocitochimica su colture bidimensionali delle linee cellulari umane di epatocarcinoma HepG2 e Huh7, stimolate con TNFα. L’analisi genica dei marcatori di EMT non ha evidenziato alcuna modulazione significativa da parte dei trattamenti. La formulazione SIL ha però dimostrato un’efficacia nella riduzione dell’espressione di PD-L1 in entrambe le linee cellulari, mentre la formulazione SL non ha causato modifiche della sua espressione. Per quanto riguarda i pathway di induzione dell’EMT, è stato osservato come SIL riduca l’mRNA della subunità di NF-kB che regola la trascrizione dei geni bersaglio (p65) nelle cellule HepG2 e l’espressione sia genica che proteica di AKT1 in entrambe le linee cellulari. Il secondo obiettivo di questo progetto di tesi è stato quello di sviluppare un modello cellulare tridimensionale più complesso, costituito da sferoidi tumorali multicellulari, ottenuti con una linea cellulare epatocitaria umana (HepG2 o Huh7) e una di cellule fibrogeniche (modello di cellule epatiche stellate, LX2). I modelli multicellulari di HepG2/LX2 e Huh7/LX2 sono stati utilizzati per verificare l’effetto delle formulazioni in esame sulla regressione dell’EMT e sull’espressione di PD-L1. Entrambe le formulazioni hanno dimostrato una tendenza a contrastare l’EMT, portando ad una diminuzione dell’espressione di proteine associate al fenotipo mesenchimale come la vimentina, e contemporaneamente all’aumento dell’espressione di E-caderina. Gli esperimenti condotti sui modelli tridimensionali hanno anche dimostrato l’efficacia del trattamento con SIL sulla riduzione dell’espressione sia di PD-L1 che di AKT1. In conclusione, i risultati ottenuti nei modelli sia bidimensionali che tridimensionali suggeriscono che la formulazione direzionata SIL sia in grado di contrastare il processo di EMT e di ridurre l’espressione del checkpoint immunitario PD-L1. Al contrario, la formulazione SL è meno efficace nel modulare questi eventi. Tuttavia, è importante sottolineare come i risultati ottenuti nei modelli tridimensionali siano ancora preliminari e richiedano ulteriori approfondimenti. L'ottimizzazione dei modelli 3D e la validazione dei risultati saranno essenziali per confermare l'efficacia di queste formulazioni e per esplorare in modo approfondito i loro meccanismi e, auspicabilmente, nuove applicazioni terapeutiche.
2023
Effects of liposomal formulations targeting the PD-L1 immune checkpoint in two- and three-dimensional cellular models of hepatocellular carcinoma
Epatocarcinoma
Liposomi
PD-L1
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