Gli RNA terapeutici costituiscono una nuova classe di farmaci in grado di modulare l'espressione genica di determinate proteine regolando la trascrizione o la traduzione dei relativi mRNA. Gli oligonucleotidi più utilizzati a questo scopo sono siRNA (piccoli RNA interferenti), miRNA (microRNA) e ASO (oligonucleotidi antisenso). Le principali problematiche riscontrate nell’utilizzo di RNA terapeutici comprendono la loro breve emivita, causata dalla degradazione ribonucleasica e dall'azione di componenti del sistema immunitario, la difficoltà di garantire un rilascio mirato, e problemi connessi alla scelta della via di somministrazione. Per risolvere queste problematiche spesso gli oligonucleotidi vengono veicolati tramite l’utilizzo di sistemi di rilascio, come nanoparticelle. In questo progetto di tesi, sono stati esplorati complessi generati dall'interazione tra avidina – una glicoproteina basica omotetramerica – e acidi nucleici, per veicolare siRNA terapeutici. In particolare, sono stati studiati due tipi di strutture: (i) le nanoparticelle ANANAS, formate da molecole di avidina condensate attorno a un filamento circolare di DNA non codificante, capaci di legare molecole biotinilate e quindi, in grado di trasportare siRNA biotinilati; (ii) assemblati derivanti dall'interazione diretta tra avidina e siRNA. Il progetto ha previsto la continuazione degli studi precedentemente avviati su formulazioni a base di nanoparticelle ANANAS, con l'obiettivo di ottimizzarle per determinare il grado di protezione dalle ribonucleasi sieriche e individuare la formulazione più promettente in termini di resistenza enzimatica. Gli studi elettroforetici hanno rivelato differenze nella degradazione per effetto di ribonucleasi sieriche dei b-SS-siRNA GFP e VDAC, mostrando una maggiore fragilità del secondo. Quando i siRNA sono stati caricati su nanoparticelle ANANAS core, è migliorata la stabilità del GFP, ma non del VDAC. Successivamente, sono state testate formulazioni multifunzionali di nanoparticelle ANANAS contenenti b-PEG-Cetuximab e b-Fus4, che hanno ulteriormente aumentato la resistenza del GFP, senza però influire sul VDAC. Infine, una formulazione contenente anche b-PEG-BSA è stata testata, ma non ha prodotto miglioramenti significativi né per il GFP né per il VDAC. Inoltre, il progetto ha incluso lo studio dell’affinità d’interazione tra avidina e siRNA al variare delle condizioni di assemblaggio, ovvero: in acqua; in tampone fosfato pH 7,4; con avidina biotinilata; in presenza di avidina funzionalizzata con b-m-PEG o b-Fus4; in presenza di un plasmide. Le analisi elettroforetiche hanno confermato sia la formazione che la reversibilità, dopo trattamento con eparina, delle interazioni avidina-siRNA. Indagini di dynamic light scattering (DLS) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) hanno rivelato la formazione di un sistema altamente polidisperso costituito da strutture supramolecolari le cui dimensione (25, 50, 100 o >100 nm) dipendono dalle condizioni di processo. Le analisi di cromatografia a esclusione dimensionale (FPLC) hanno confermato la natura eterogenea del sistema, suggerendo la formazione di complessi avidina-siRNA che presentano un range dimensionale ampio. Inoltre, le analisi elettroforetiche hanno evidenziato che gli assemblati avidina-siRNA offrono protezione all’oligonucleotide, riducendo la sua degradazione da parte delle ribonucleasi sieriche.
Approcci nanotecnologici per la veicolazione di RNA terapeutici: strategie di delivery basate sull’interazione avidina-acidi nucleici
FRIGATO, CHIARA
2023/2024
Abstract
Gli RNA terapeutici costituiscono una nuova classe di farmaci in grado di modulare l'espressione genica di determinate proteine regolando la trascrizione o la traduzione dei relativi mRNA. Gli oligonucleotidi più utilizzati a questo scopo sono siRNA (piccoli RNA interferenti), miRNA (microRNA) e ASO (oligonucleotidi antisenso). Le principali problematiche riscontrate nell’utilizzo di RNA terapeutici comprendono la loro breve emivita, causata dalla degradazione ribonucleasica e dall'azione di componenti del sistema immunitario, la difficoltà di garantire un rilascio mirato, e problemi connessi alla scelta della via di somministrazione. Per risolvere queste problematiche spesso gli oligonucleotidi vengono veicolati tramite l’utilizzo di sistemi di rilascio, come nanoparticelle. In questo progetto di tesi, sono stati esplorati complessi generati dall'interazione tra avidina – una glicoproteina basica omotetramerica – e acidi nucleici, per veicolare siRNA terapeutici. In particolare, sono stati studiati due tipi di strutture: (i) le nanoparticelle ANANAS, formate da molecole di avidina condensate attorno a un filamento circolare di DNA non codificante, capaci di legare molecole biotinilate e quindi, in grado di trasportare siRNA biotinilati; (ii) assemblati derivanti dall'interazione diretta tra avidina e siRNA. Il progetto ha previsto la continuazione degli studi precedentemente avviati su formulazioni a base di nanoparticelle ANANAS, con l'obiettivo di ottimizzarle per determinare il grado di protezione dalle ribonucleasi sieriche e individuare la formulazione più promettente in termini di resistenza enzimatica. Gli studi elettroforetici hanno rivelato differenze nella degradazione per effetto di ribonucleasi sieriche dei b-SS-siRNA GFP e VDAC, mostrando una maggiore fragilità del secondo. Quando i siRNA sono stati caricati su nanoparticelle ANANAS core, è migliorata la stabilità del GFP, ma non del VDAC. Successivamente, sono state testate formulazioni multifunzionali di nanoparticelle ANANAS contenenti b-PEG-Cetuximab e b-Fus4, che hanno ulteriormente aumentato la resistenza del GFP, senza però influire sul VDAC. Infine, una formulazione contenente anche b-PEG-BSA è stata testata, ma non ha prodotto miglioramenti significativi né per il GFP né per il VDAC. Inoltre, il progetto ha incluso lo studio dell’affinità d’interazione tra avidina e siRNA al variare delle condizioni di assemblaggio, ovvero: in acqua; in tampone fosfato pH 7,4; con avidina biotinilata; in presenza di avidina funzionalizzata con b-m-PEG o b-Fus4; in presenza di un plasmide. Le analisi elettroforetiche hanno confermato sia la formazione che la reversibilità, dopo trattamento con eparina, delle interazioni avidina-siRNA. Indagini di dynamic light scattering (DLS) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) hanno rivelato la formazione di un sistema altamente polidisperso costituito da strutture supramolecolari le cui dimensione (25, 50, 100 o >100 nm) dipendono dalle condizioni di processo. Le analisi di cromatografia a esclusione dimensionale (FPLC) hanno confermato la natura eterogenea del sistema, suggerendo la formazione di complessi avidina-siRNA che presentano un range dimensionale ampio. Inoltre, le analisi elettroforetiche hanno evidenziato che gli assemblati avidina-siRNA offrono protezione all’oligonucleotide, riducendo la sua degradazione da parte delle ribonucleasi sieriche.File | Dimensione | Formato | |
---|---|---|---|
Frigato_Chiara.pdf
accesso riservato
Dimensione
4.72 MB
Formato
Adobe PDF
|
4.72 MB | Adobe PDF |
The text of this website © Università degli studi di Padova. Full Text are published under a non-exclusive license. Metadata are under a CC0 License
https://hdl.handle.net/20.500.12608/80625