Il composto 02004 (PM = 467,2805 Da), caratterizzato da elevata lipofilicità, è attualmente in corso di valutazione preclinica come candidato farmaco antitumorale. Tale fase di sperimentazione permette di ottenere le informazioni necessarie per progettare degli studi clinici. Gli obiettivi di questa tesi sono stati la valutazione della stabilità metabolica e della tossicità di 02004 mediante test in vitro e in vivo. La prima parte del progetto è stata focalizzata sullo studio della stabilità di 02004 in plasma di ratto e della sua stabilità metabolica. Quest’ultima è stata valutata in due modelli predittivi del metabolismo epatico, ovvero microsomi epatici umani (HLM) e baculosomi esprimenti CYP3A4. Per quanto riguarda la stabilità in plasma, le valutazioni analitiche eseguite mediante UPLC-MS sul campione dopo incubazione hanno evidenziato che l’intensità del picco di 02004, e di conseguenza la sua concentrazione, sono rimaste stabili al variare del tempo di incubazione con il plasma di ratto. Per quanto riguarda invece la stabilità metabolica, gli EIC (Extracted Ion Chromatogram) corrispondenti a 02004 hanno mostrato una limitata (pari a circa il 13% dopo 30 minuti di incubazione) diminuzione del segnale all’aumentare dei tempi di incubazione, indice di reazioni di biotrasformazione. Al fine di identificare la struttura di eventuali metaboliti, sono stati ricercati dei picchi inserendo valori m/z pari ai pesi molecolari dei più probabili prodotti di biotrasformazione del composto di partenza. Le strutture ipotizzabili corrispondono ad un derivato demetilato (m/z = 453,2649) e ad uno idrossilato (m/z = 483,2755). Infine, l’esperimento con baculosomi esprimenti CYP3A4, eseguito allo scopo di valutare il coinvolgimento di questo enzima nel metabolismo di 02004, ha evidenziato la produzione degli stessi metaboliti anche in questo modello, dimostrando che CYP3A4 è il principale enzima responsabile del metabolismo di 02004. Oltre ai test in vitro, è stato effettuato uno studio di tossicità in vivo per valutare sia la tossicità acuta di 02004, in seguito ad una singola somministrazione orale di 60 mg/kg di 02004 a ratti del ceppo Sprague-Dawley, che la tossicità conseguente a 7 somministrazioni giornaliere di una dose inferiore (30 mg/kg). In questi animali, oltre alla misurazione del peso corporeo e degli organi asportati il giorno del sacrificio, è stata valutata la tossicità d’organo, mediante esame istologico dei principali organi (cuore, polmoni, reni, milza, fegato e cervello), e l’ematotossicità, mediante 8 l’emocromo e i parametri biochimici plasmatici degli animali. Il composto 02004 non ha avuto effetti sul peso degli animali e dei loro organi e non ha causato tossicità rilevabile istologicamente nei 6 organi valutati, né dopo la singola somministrazione, né dopo il trattamento di 7 giorni. Le uniche differenze statisticamente significative osservate in seguito al trattamento dalle analisi del sangue, sono state l’incremento di ematocrito, emoglobina e fosfato inorganico nello studio di tossicità acuta e la diminuzione di fosfato inorganico in seguito alle somministrazioni ripetute. Considerata la scarsa entità di queste variazioni, questi risultati non sono probabilmente indicativi di una tossicità clinicamente rilevante. In conclusione, i promettenti risultati ottenuti in questa tesi riguardo al suo profilo farmacocinetico e tossicologico, supportano la prosecuzione dello sviluppo del candidato farmaco 02004.
Studio della stabilità metabolica e della tossicità del candidato farmaco 02004
MEGA, AMEDEO
2023/2024
Abstract
Il composto 02004 (PM = 467,2805 Da), caratterizzato da elevata lipofilicità, è attualmente in corso di valutazione preclinica come candidato farmaco antitumorale. Tale fase di sperimentazione permette di ottenere le informazioni necessarie per progettare degli studi clinici. Gli obiettivi di questa tesi sono stati la valutazione della stabilità metabolica e della tossicità di 02004 mediante test in vitro e in vivo. La prima parte del progetto è stata focalizzata sullo studio della stabilità di 02004 in plasma di ratto e della sua stabilità metabolica. Quest’ultima è stata valutata in due modelli predittivi del metabolismo epatico, ovvero microsomi epatici umani (HLM) e baculosomi esprimenti CYP3A4. Per quanto riguarda la stabilità in plasma, le valutazioni analitiche eseguite mediante UPLC-MS sul campione dopo incubazione hanno evidenziato che l’intensità del picco di 02004, e di conseguenza la sua concentrazione, sono rimaste stabili al variare del tempo di incubazione con il plasma di ratto. Per quanto riguarda invece la stabilità metabolica, gli EIC (Extracted Ion Chromatogram) corrispondenti a 02004 hanno mostrato una limitata (pari a circa il 13% dopo 30 minuti di incubazione) diminuzione del segnale all’aumentare dei tempi di incubazione, indice di reazioni di biotrasformazione. Al fine di identificare la struttura di eventuali metaboliti, sono stati ricercati dei picchi inserendo valori m/z pari ai pesi molecolari dei più probabili prodotti di biotrasformazione del composto di partenza. Le strutture ipotizzabili corrispondono ad un derivato demetilato (m/z = 453,2649) e ad uno idrossilato (m/z = 483,2755). Infine, l’esperimento con baculosomi esprimenti CYP3A4, eseguito allo scopo di valutare il coinvolgimento di questo enzima nel metabolismo di 02004, ha evidenziato la produzione degli stessi metaboliti anche in questo modello, dimostrando che CYP3A4 è il principale enzima responsabile del metabolismo di 02004. Oltre ai test in vitro, è stato effettuato uno studio di tossicità in vivo per valutare sia la tossicità acuta di 02004, in seguito ad una singola somministrazione orale di 60 mg/kg di 02004 a ratti del ceppo Sprague-Dawley, che la tossicità conseguente a 7 somministrazioni giornaliere di una dose inferiore (30 mg/kg). In questi animali, oltre alla misurazione del peso corporeo e degli organi asportati il giorno del sacrificio, è stata valutata la tossicità d’organo, mediante esame istologico dei principali organi (cuore, polmoni, reni, milza, fegato e cervello), e l’ematotossicità, mediante 8 l’emocromo e i parametri biochimici plasmatici degli animali. Il composto 02004 non ha avuto effetti sul peso degli animali e dei loro organi e non ha causato tossicità rilevabile istologicamente nei 6 organi valutati, né dopo la singola somministrazione, né dopo il trattamento di 7 giorni. Le uniche differenze statisticamente significative osservate in seguito al trattamento dalle analisi del sangue, sono state l’incremento di ematocrito, emoglobina e fosfato inorganico nello studio di tossicità acuta e la diminuzione di fosfato inorganico in seguito alle somministrazioni ripetute. Considerata la scarsa entità di queste variazioni, questi risultati non sono probabilmente indicativi di una tossicità clinicamente rilevante. In conclusione, i promettenti risultati ottenuti in questa tesi riguardo al suo profilo farmacocinetico e tossicologico, supportano la prosecuzione dello sviluppo del candidato farmaco 02004.File | Dimensione | Formato | |
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https://hdl.handle.net/20.500.12608/80629