VENTRAL MIDBRAIN ORGANOIDS FOR MODELLING A RARE GENETIC DISEASE: THERAPEUTIC INTERVENTION IN TYROSINE HYDROXYLASE DEFICIENCY

Tyrosine hydroxylase deficiency (THD) is an ultrarare genetic neurometabolic disorder caused by mutations in the tyrosine hydroxylase (TH) enzyme, leading to impaired protein stability, accelerated degradation, and catecholamine deficiency. TH is involved in the rate-limiting step of dopamine (DA) synthesis, and its dysfunction results in reduced DA levels in the brain, often causing early-onset parkinsonism. Despite understanding the role of TH in DA deficiency, the genotype-phenotype correlation remains unclear. The disease presents a broad phenotypic spectrum, categorized based on the severity of symptoms and responsiveness to L-dopa treatment. Mild forms (THDA) are characterized by motor impairments with good response to L-dopa, whereas severe forms (THDB) exhibit significant motor and cognitive delays, with no treatment response and severe side effects even at low doses of the drug. To study the pathogenic mechanisms of the disease, particularly in severe L-dopa-unresponsive cases, it is essential to find models that capture the specific and heterogeneous alterations of THD. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) provide a powerful platform for generating patient-specific models that reflect the patient’s genotype and allow personalized drug testing. In this study, we successfully developed ventral midbrain organoids (vmO) derived from THDB patient-specific iPSCs and healthy controls. These organoids recapitulate the three-dimensional tissue architecture and cellular interactions of the midbrain. Our findings showed that THDB-derived organoids present a reduced number of TH-positive cells, abnormal neuron morphology, including decreased neurite length and branching, when analysed at day 60. These morphological defects were likely associated with altered functional activity, which could contribute to the disease pathology. Consistent with patient phenotypes, THDB-derived organoids displayed lower levels of TH protein expression and homovanillic acid (HVA), a DA metabolite. We further explored the effects of BH4, the TH cofactor tetrahydrobiopterin, on the stability of TH and its ability to prevent premature degradation, demonstrating increased TH protein expression and TH+ cell numbers at day 60, indicating a protective role for BH4. Our model offers a unique platform for studying dopaminergic neuron formation, functionality, and DA release. Additionally, it has been validated as a representative disease model for drug repurposing to prevent disease-specific cellular phenotypes.

La deficienza di tirosina idrossilasi (THD) è un disturbo neurometabolico genetico molto raro causato da mutazioni nell'enzima tirosina idrossilasi (TH), che ne determina instabilità proteica, degradazione accelerata e conseguente carenza di catecolamine. La TH è un enzima chiave nella sintesi della dopamina (DA) e una sua disfunzione determina una riduzione dei livelli di DA nel sistema nervoso centrale, causando parkinsonismo a esordio precoce. Ad oggi il ruolo della TH nella carenza di DA e la relativa associazione genotipo-fenotipo risultano ancora poco chiari. La malattia presenta un ampio spettro fenotipico, che viene categorizzato in base alla gravità dei sintomi e alla reattività al trattamento con L-dopa. Le forme lievi (THDA) sono caratterizzate da alterazioni motorie con buona risposta alla L-dopa, mentre le forme gravi (THDB) determinano significativi ritardi motori e cognitivi, senza risposta al trattamento con L-dopa e con gravi effetti collaterali anche a basse dosi del farmaco. Per studiare i meccanismi alla base della malattia è essenziale trovare modelli che rappresentino le alterazioni eterogenee della THD. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) forniscono una importante piattaforma per generare modelli specifici che riflettono il genotipo del paziente e consentono test farmacologici personalizzati. In questo studio, abbiamo sviluppato con successo organoidi del mesencefalo ventrale (vmO) derivati da iPSC sia di paziente affetto da THDB che di soggetto controllo sano. Gli organoidi riproducono la struttura 3D tissutale e le interazioni cellulari presenti nel mesencefalo. I nostri risultati hanno dimostrato che gli organoidi derivati da campioni tissutali di un paziente con THDB presentano ridotto numero di cellule TH+, una anomala morfologia neuronale, tra cui una ridotta lunghezza e/o ramificazione dei neuriti, quando analizzati al giorno 60. Questi difetti morfologici sono probabilmente associati a un'attività funzionale alterata, che potrebbe contribuire alla patologia della malattia. Gli organoidi derivati da campioni tissutali di un paziente con THDB hanno evidenziato una ridotta espressione proteica di TH e minori livelli di acido omovanillico (HVA), un metabolita della DA. Abbiamo successivamente analizzato gli effetti del cofattore di TH, la tetraidrobiopterina (BH4), sulla stabilità dell’enzima e sulla sua capacità di prevenire la degradazione prematura. L’esposizione a BH4 degli organoidi di tessuto malato di THDB ha indotta un’aumentata espressione di TH e un in incremento significativo di cellule TH+ al giorno 60, ad indicare il ruolo protettivo di BH4. Il nostro modello offre quindi una piattaforma unica per studiare la formazione dei neuroni dopaminergici, la funzionalità e il rilascio di DA nonché l’opportunità di valutare e validare possibili nuovi farmaci utili a prevenire fenotipi cellulari specifici della malattia.